Dieses Protokoll stellt ein neues Reporter-Gensystem und den Versuchsaufbau zum Nachweis der Transkription bei DNA-Doppelstrangbrüchen mit Einzelmolekülsensitivität vor.
DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind die schwerste Art von DNA-Schäden. Trotz der katastrophalen Folgen für die Integrität des Genoms ist es bisher schwer fassbar, wie DSBs die Transkription beeinflussen. Ein Grund dafür war der Mangel an geeigneten Werkzeugen, um die Transkription und die Induktion eines genischen DSB mit ausreichender zeitlicher und räumlicher Auflösung gleichzeitig zu überwachen. Diese Arbeit beschreibt eine Reihe neuer Reporter, die die Transkription in lebenden Zellen unmittelbar nach der Induktion eines DSB in der DNA-Vorlage direkt visualisieren. Bakteriophagen-RNA-Stammschleifen werden verwendet, um die Transkription mit Einzelmolekülempfindlichkeit zu überwachen. Um das DSB auf eine bestimmte Genregion auszurichten, werden die Reportergene so konstruiert, dass sie eine einzige Erkennungssequenz der Homing-Endonuklease I-SceI enthalten, die sonst im menschlichen Genom fehlt. Eine einzelne Kopie jedes Reportergens wurde in das Genom menschlicher Zelllinien integriert. Dieses experimentelle System ermöglicht den Nachweis einzelner RNA-Moleküle, die durch die kanonische Gentranskription oder durch DNA-Break-induzierte Transkriptionsinitiierung erzeugt werden. Diese Reporter bieten eine beispiellose Gelegenheit, die wechselseitigen Wechselwirkungen zwischen Transkription und DNA-Schäden zu interpretieren und bisher ungeschätzte Aspekte der DNA-Bruch-induzierten Transkription offenzulegen.
DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) sind toxische DNA-Läsionen, die die Zellfunktion stören und zum Auftreten mehrerer Krankheiten und zum Altern beitragen1. Mutationen, die aus der ungenauen Reparatur von DSBs resultieren, beeinflussen die Genexpression und bilden die Grundlage für den funktionellen Verfall der Zelle. Die aufkommende Ansicht, dass DSBs die de novo breakinduzierte Transkription an der Läsionsstelle vorantreiben2,3,4,5,6,7 legt nahe, dass DSBs auch die zelluläre Funktion durch bruchinduzierte RNAs beeinflussen können. Mehrere neuere Studien deuten darauf hin, dass DSBs ausreichen, um eine programmierte (z. B. an stimulusinduzierbaren Genen) und ungeplante (z. B. an nicht-kanonischen Promotoren) Transkription zu initiieren4,5,7. Trotz mehrerer Studien, die die Zusammenhänge zwischen DNA-Schäden und Transkription untersuchten, hinkte das Feld jedoch immer noch in seiner Fähigkeit hinterher, eine präzise (d.h. Einzelmolekül-) Charakterisierung der transkriptionellen Ereignisse an DNA-Bruchstellen zu liefern. Ein wichtiger Grund dafür war der Mangel an geeigneten experimentellen Werkzeugen. Zellbestrahlung (γ, Röntgenstrahlen, Schwerionen) und medikamentöse Behandlungen (z. B. Topoisomerase-Inhibitoren oder Interkalationsmittel) sind nicht räumlich präzise und induzieren andere DNA-Läsionen als DSBs, einschließlich Einzelstrangbrüche und DNA-Addukte8. Endonukleasen wie I-PpoI und AsiSI erzeugen lokusspezifische DSBs, wurden jedoch nicht mit einem System kombiniert, das die gleichzeitige Visualisierung der Transkription an einem einzelnen Ort mit hoher zeitlicher Präzision ermöglicht8. Um diese Einschränkung zu umgehen, führte unser Labor die Entwicklung einer Reihe von hochmodernen Reportern an, die die Transkription mit Einzelmolekülauflösung bei der kontrollierten Induktion eines einzigartigen DSB4 direkt visualisieren. Hier beschreiben wir diese Reporter, stellen ein detailliertes Protokoll für die Live-Cell-Bildgebung der Transkription an DSBs zur Verfügung und zeigen Daten, die die Transkriptionsinitiation an einem einzelnen DSB aufdecken.
Die in diesem Protokoll verwendeten Reporter-Gensysteme basieren auf dem gut charakterisierten Maus-IgM-Reporter-Gen und enthalten die Exons M1 und M2 der membrangebundenen Form (μm) der IgM-μ schweren Kette9,10,11. Ein Hybrid-Intron trennt die beiden Exons mit dem starken Adenovirus Major Late Transcript (AdML) PY tract12. Die Expression der Reportergene wird durch den humanen Cytomegalovirus-Promotor (CMV) gesteuert, in den zwei Tandemkopien der Tet-Operator-Sequenz (TetO) eingefügt wurden. Die Reportergene werden jeweils in einen Plasmidvektor eingefügt, der eine FLP-Rekombinationszielstelle (FRT) enthält, und in eine spezifische FRT-Zielstelle im Genom einer HEK293-Wirtszelllinie eingefügt. Diese Zelllinie exprimiert auch konstitutiv das Tet-Repressorprotein, um die Expression des Reportergens durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von Tetracyclin / Doxycyclin zu regulieren. Um die Visualisierung der Reporter-Gentranskription zu ermöglichen, wurden 24 Tandemwiederholungen der MS2-Stammschleifensequenz und 24 Tandemwiederholungen der PP7-Stammschleifensequenz an verschiedenen Positionen in Bezug auf die Transkriptionsstartstelle und die Exon/Intron-Struktur des Reportergens eingefügt. Die MS2/PP7-RNA-Stammschleifen bilden sich bei der Transkription und werden spezifisch durch ektopisch exprimierte MS2/PP7-Mantelproteine gebunden, die mit grün und rot fluoreszierenden Proteinen markiert sind, eine Strategie, die vor der Bildtranskription weit verbreitet war13,14,15. Darüber hinaus wurde eine einzelne Kopie der 18 bp-Erkennungssequenz für die Homing-Endonuklease I-SceI eingefügt, die direkt von den RNA-Stamm-Schleifen-Sequenzarrays in den Reportergenen flankiert wird. Standard-Klonierungstechniken wurden verwendet, um alle Plasmide zu erzeugen, das Fragment, das die I-SceI-24xMS2-Stammschleife des PROP-Reportergens enthielt, wurde von einem kommerziellen Gensynthesedienst synthetisiert.
Das Promotor-proximale DSB-Reporter-Gen (PROP) wurde konstruiert, indem die I-SceI-Schnittstelle 45 Basenpaare (bp) stromabwärts der mutmaßlichen Transkriptionsstartstelle in Exon I eingefügt wurde, gefolgt von 149 bp bis zum Start der 24x MS2-Stammschleifenkassette, die de novo mit zwei abwechselnden, nicht identischen Stammschleifensequenzen entworfen wurde16 und zusätzliche fünf sich nicht wiederholende 20-bp-Abstandshaltersequenzen, um Redundanz zu reduzieren. Auf das MS2 Stem-Loop-Array folgen 72 bp bis zum Beginn des 1844 bp Introns und das 1085 bp Exon II bis zur Spaltungs- und Polyadenylierungsstelle. Das Exon II kodiert für ein cyanfarbenes fluoreszierendes Protein (CFP), das mit einer C-terminalen peroxisomalen Targeting-Sequenz (PTS) aus der humanen peroxisomalen Acyl-CoA-Oxidase fusioniert ist, um ein unabhängiges Screening der Reportergenexpression zu ermöglichen (Abbildung 1A).
Das Exon II DSB-Reportergen (EX2) besteht aus einem 167 bp Exon I, gefolgt vom Intron und Exon II, die für das CFP-PTS kodieren. Weiter stromabwärts wurde in einem Abstand von 169 bp eine Kassette mit 24x MS2-Stem-Loops eingefügt, gefolgt von einer 84 bp Linkersequenz mit einer I-SceI-Stelle in der Mitte, gefolgt von 24x PP7-Stammschleifen und 221 bp bis zur Spaltungs- und Polyadenylierungsstelle17 (Abbildung 1B).
Schließlich basiert das Exon II DSB-Reportergen mit Antisense-Transkriptionsmarkierung (EX2AS) auf dem humanen Ubiquitin B (UBB)-Gentranskript UBB-201 und enthält zwei Exons und ein Intron. Das Exon I hat eine Gesamtlänge von 1534 bp mit einer inversen Insertion der 24x MS2 Stem-Loop-Sequenz. Daher wird die korrekte MS2-Stammschleifen-RNA-Sequenz in eine Antisense-Richtung in Bezug auf die Sinnestranskription des Reportergens vom CMV-Promotor transkribiert. Das Intron hat eine Länge von 490 bp, gefolgt von Exon II mit der I-SceI-Stelle , und eine kodierende Region wurde für zwei In-Frame-Ubiquitin-Untereinheiten eingefügt. Stromabwärts des UBB-Gens befindet sich eine Sequenz, die bei der Transkription des Reportergens in eine Sinnesrichtung eine 24x PP7-Stammschleife bildet (Abbildung 1C).
Die transiente Transfektion eines induzierbaren Konstrukts der Homing-Endonuklease I-SceI ermöglicht die kontrollierte Erzeugung eines DSB an der eingefügten Erkennungsstelle innerhalb jedes Reportergens18. Die I-SceI-Endonuklease ist im Rahmen mit der ligandenbindenden Domäne des Glukokortikoidrezeptors und einem weit rot fluoreszierenden Protein iRFP713 verschmolzen. Dieses Konstrukt ist in Abwesenheit von Triamcinolonacetonid (TA) zytoplasmatisch, wandert aber bei Zugabe von TA zum Wachstumsmedium der Zellen schnell in den Zellkern ein (Abbildung 1D). Die Induktion von DSBs durch das I-SceI-System ist robust, wie vor 18,19,20 gezeigt. Die Reporter-Gentranskription kann parallel überwacht werden, indem die fluoreszierend markierten RNA-Stammschleifensysteme MS2 und PP7 visualisiert werden.
Konflikte zwischen essentiellen biologischen Prozessen wie Replikation, Transkription, DNA-Schäden und DNA-Reparatur wurden als kritische Quelle der Genominstabilität identifiziert22. Diese Studien haben auch zur Entdeckung der Transkription an Stellen von DNA-Schäden geführt und den bruchinduzierten Transkripten eine funktionelle Rolle bei der Regulierung von DNA-Schadensreparaturprozessen zugeschrieben23. Die neuen Werkzeuge und das hier beschriebene Protokoll ermöglichen eine weitere Untersuchung der RNA Pol II-Transkriptionsdynamik an DSBs. Ein kritischer Punkt in diesem Protokoll ist die Erzeugung von Zelllinien, die eine einzige Kopie des in das Genom integrierten Reportergens enthalten. Diese Schlüsselfunktion eliminiert das Rauschen, das durch die Transkription mehrerer Reportergene entsteht, die mit mehreren Kopien in einem einzigen genomischen Locus integriert sind, und ermöglicht die Erfassung kinetischer Parameter der Transkriptionsdynamik und einzelner RNA-Transkripte. Eine entscheidende technische Voraussetzung für die Beobachtung der Transkription von Single-Reporter-Genintegrationen ist die Verfügbarkeit eines Mikroskopsystems, das den Nachweis einzelner RNA-Transkripte ermöglicht, die mit dem MS2- oder PP7-System in lebenden Zellen markiert sind4,12. Hier wird die Live-Cell-Mikroskopie an einem konfokalen Spinning Disk-System durchgeführt, das auf einem inversen Mikroskop montiert ist und mit 100 mW Festkörperlasern ausgestattet ist, die an einen akustisch-optisch abstimmbaren Filter gekoppelt sind, wie an anderer Stelle beschrieben24. Um die Transkription an einem einzelnen DSB mit den Reportern zu untersuchen, müssen einzelne Zellen sorgfältig überwacht werden, um die höchste Zeitauflösung zu erreichen, die bildgebende Zellen für mehrere Stunden erfordert, was dies zu einem Test mit niedrigem Durchsatz macht. Dennoch beobachten wir mehrere Zellen parallel mit der Positionierung, die von einem piezogetriebenen Mikroskoptisch gesteuert wird. Um optimale Umgebungsbedingungen für die Beobachtung lebender Zellen über Stunden zu gewährleisten, wird der Mikroskopkörper einschließlich der Probenstufe in eine Plexiglas-Umgebungskammer gelegt. Zusätzlich ist eine geschlossene Inkubationskammer auf dem Mikroskoptisch montiert und an CO2– und Feuchteversorgungsregler angeschlossen.
Der erste kritische Schritt im Protokoll ist die Auswahl von Regionen von Interesse mit Zellen für die Bildgebung. Jede für die Bildgebung markierte XY-Position muss eine oder mehrere Zellen enthalten, die eine Transfektion mit den fluoreszierenden RNA-Stammschleifen-bindenden Proteinen gemäß dem in Abschnitt 1, Tabelle 1, sowie in Abbildung 2D, E beschriebenen Reportergen und Transfektionsschema zeigen. Darüber hinaus müssen die Zellen hell markierte Transkriptionsstellen aufweisen, die mit dem I-SceI-GR-iRFP713-Konstrukt kotransfiziert werden müssen, und das Protein muss zunächst im Zytoplasma lokalisiert sein (Abbildung 2D und E).
Die Zellen sollten eine Fluoreszenzintensität von ungebunden fluoreszierend markiertem MS2- und/oder PP7-Mantelprotein aufweisen, die niedrig genug ist, um einzelne markierte Transkripte über dem Hintergrundfluoreszenzniveau nachzuweisen. Gleichzeitig ist ein robustes Fluoreszenzintensitätsniveau der fluoreszenzmarkierten MS2- und/oder PP7-Beschichtungsproteine erforderlich, um eine Bildgebung über mindestens 60 min zu ermöglichen, ohne zu viel Fluoreszenz aufgrund einer Bleiche zu verlieren. Die “Skalenbildanzeige” mit einem festen Bereich wie in Abschnitt 3.7 beschrieben wird verwendet, um eine standardisierte Auswahl von Zellen nach ihrem Fluoreszenzintensitätsniveau zu ermöglichen.
Ein zweiter kritischer Protokollschritt ist das Hinzufügen des TA zu den Zellen an vorher festgelegten XY-Positionen durch das kleine Loch im Deckel der Glasbodenschale. Jede Manipulation der Glasbodenschale würde eine Verschiebung von der markierten XY-Position der Zellen verursachen und muss vermieden werden. Daher ist der sorgfältige Umgang mit der Mikropipette bei gleichzeitiger Zugabe des im zellulären Wachstumsmedium verdünnten TA für die erfolgreiche Beobachtung vorausgewählter Zellen von entscheidender Bedeutung, wie in Abbildung 2F gezeigt. Die Anpassung verschiedener Systeme zur Zugabe von Medikamenten zu Zellen, die auf einem Mikroskoptisch montiert sind, wie z. B. ein Perfusionssystem, würde eine separate Stufeninkubationskammer mit Rohreingangs- und -austrittsöffnungen und ein Pumpen- oder Injektionssystem zur Verabreichung von Medikamenten erfordern. Andere Methoden wie Kanalobjektträger mit deckglasartigen Bodenflächen führen zu einer langsamen Diffusion der verabreichten Medikamente in den Kanal und verursachen eine zusätzliche Verzögerung zwischen Arzneimittelzugabe und Wirkung. Schließlich kann das unvorsichtige Pipettieren in eine Kanalschieberöffnung auch die Probenposition verschieben. Daher ist das derzeitige System mit einem kundenspezifisch gebohrten Loch im Deckel einer Glasbodenschale einfach anzupassen, kostengünstig und für die Verabreichung verschiedener Wachstumsmedien, Medikamente und Komponenten geeignet. Der geringe Durchmesser des Lochs und die befeuchtete Atmosphäre in der Stufeninkubationskammer verhindern zudem ein Austrocknen des Zellmediums.
Ein dritter kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Datenanalyse, die eine manuelle Überprüfung der Zeitpunkte erfordert, an denen die Transkription aufgrund der Induktion eines DSB eingestellt wird. Der Zeitpunkt der Beendigung der Transkription wird durch die Freigabe der letzten Transkripte von der zuvor hell markierten Stelle der Reporter-Gentranskription angegeben. Ebenso müssen die Ereignisse der bruchinduzierten Transkriptionsinitiation sorgfältig untersucht werden, um einzelne Transkriptionsereignisse mit dem relativ niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis einzelner fluoreszend markierter mRNAs zu erkennen.
Die Dynamik der Reparatur des induzierten DSB fügt den Analysen der mit diesen Reportern generierten Daten eine zusätzliche Komplexitätsebene hinzu und beschränkt sie auf die ersten Minuten unmittelbar nach der Induktion des DSB. Die transgene Natur der Reportergene und die wiederholungsreiche Natur der MS2- und PP7-Stammschleifen-Arrays können eine einzigartige Chromatinlandschaft zusammensetzen, die die Etablierung vermeintlich stabiler bruchinduzierter Transkriptionsprogramme stört. Im Vergleich zur Ionisations- oder UV-Bestrahlung ist die I-SceI-vermittelte Induktion eines DSB in Reportergenen jedoch ein viel robusteres System zur Untersuchung der Transkription an einzelnen DSBs.
Verschiedene Endonukleasesysteme wie I-CreI, I-PpoI oder AsiSI , die zusätzliche Erkennungsstellen innerhalb des menschlichen Genoms haben oder nicht, können mit den vorliegenden Reportergensystemen kombiniert werden, um eine mögliche höhere Effizienz der Erzeugung von DSBs zu erzielen. Sie erfordern jedoch zuerst die Einführung der Endonuklease-Erkennungsstelle in die Reportergene. Zweitens können sie eine ähnliche Variabilität bei der Timing- und Effizienzinduktion eines DSB in einzelnen Zellen aufweisen. Auf der anderen Seite kann das Einfügen von Tandemkopien von Endonuklease-Erkennungsstellen die Effizienz der DSB-Induktion erhöhen. Darüber hinaus würde das Testen der vorgestellten Reporter-Gensysteme in verschiedenen Zelllinien den Vergleich der Transkriptionsdynamik an DSB-Stellen zwischen verschiedenen zellulären Hintergründen und die Verfügbarkeit verschiedener DNA-Schadensreparaturwege wie in Krebszellen, Primärzellen und differenzierten nicht-zyklischen Zellen ermöglichen. Die Konstruktion der Reportergene, die mit dem Flp/FRT-System kompatibel sind, schränkt derzeit jedoch die Integration in verfügbare Flp/FRT-Wirtszelllinien ein.
Zusätzlich zu mikroskopiebasierten Anwendungen können die aktuellen Reportergene auch mit biochemischen Assays wie der Chromatin-Immunpräzipitation kombiniert werden, um die Rekrutierung von DNA-Reparatur- oder Transkriptionsfaktoren für ein einzelnes DSB zu untersuchen oder die Nukleosombelegung, Histonmodifikationen und den Chromatinzustand um den DSB-Standort zu bewerten. Darüber hinaus würde eine Kombination mit verschiedenen Reportersystemen die Untersuchung funktioneller Zusammenhänge zwischen DNA-Schäden und Prozessen wie Genomorganisation oder DNA-Replikation ermöglichen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca für geschenke von plasmiden und reagenzien. Wir sind auch den Mitarbeitern der iMM Bioimaging Facility, A. Temudo, A. Nascimento und J. Rino, für die kritische Lektüre des Manuskripts zu Dank verpflichtet. Diese Arbeit wurde von PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 und PTDC/MED-OUT/4301/2020 von Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal, und von LISBOA-01-0145-FEDER-007391, einem von FEDER über POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa und FCT kofinanzierten Projekt, finanziert. Gefördert wurde auch das FORSCHUNGS- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der EU (RiboMed 857119). M.A. ist der Empfänger des FCT Ph.D. Fellowship 2020.05899.BD.
100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
DMEM | Gibco | 41966029 | |
DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
FBS | Gibco | 10270106 | |
Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |