Dit protocol presenteert een nieuw reporter-gensysteem en de experimentele opstelling om transcriptie te detecteren bij DNA-dubbelstrengsbreuken met gevoeligheid van één molecuul.
DNA dubbelstrengs breuken (DSB) zijn de meest ernstige vorm van DNA-schade. Ondanks de catastrofale gevolgen voor de genoomintegriteit, blijft het tot nu toe ongrijpbaar hoe DSB’s transcriptie beïnvloeden. Een reden hiervoor was het ontbreken van geschikte tools om gelijktijdig transcriptie en de inductie van een genic DSB met voldoende temporele en ruimtelijke resolutie te monitoren. Dit werk beschrijft een reeks nieuwe verslaggevers die transcriptie in levende cellen direct visualiseren onmiddellijk na de inductie van een DSB in de DNA-sjabloon. Bacteriofaag RNA-stamlussen worden gebruikt om de transcriptie te controleren met gevoeligheid voor één molecuul. Voor het richten van de DSB op een specifiek gengebied, zijn de reportergenen ontworpen om een enkele herkenningssequentie van de homing endonuclease I-SceI te bevatten, anders afwezig in het menselijk genoom. Een enkele kopie van elk reporter-gen werd geïntegreerd in het genoom van menselijke cellijnen. Dit experimentele systeem maakt de detectie mogelijk van enkele RNA-moleculen die worden gegenereerd door de canonieke gentranscriptie of door DNA-break-geïnduceerde transcriptie-initiatie. Deze verslaggevers bieden een ongekende kans om de wederzijdse interacties tussen transcriptie en DNA-schade te interpreteren en om tot nu toe niet-gewaardeerde aspecten van DNA-break-geïnduceerde transcriptie te onthullen.
DNA dubbelstrengsbreuken (DSB’s) zijn toxische DNA-laesies die de celfunctie verstoren en bijdragen aan de opkomst van verschillende ziekten en veroudering1. Mutaties als gevolg van het onnauwkeurige herstel van DSB’s beïnvloeden de genexpressie en leggen de basis voor de functionele achteruitgang van de cel. De emergente opvatting dat DSB’s de novo break-geïnduceerde transcriptie op de laesieplaats2,3,4,5,6,7 aansturen, suggereert dat DSB’s ook de cellulaire functie kunnen beïnvloeden door break-geïnduceerde RNA’s. Verschillende recente studies geven aan dat DSB’s voldoende zijn om geprogrammeerde (bijv. stimulus-induceerbare genen) en ongeplande (bijv. bij niet-canonieke promotors) transcriptie4,5,7 te initiëren. Ondanks verschillende studies die de verbanden tussen DNA-schade en transcriptie onderzochten, bleef het veld echter nog steeds achter in zijn capaciteit om een nauwkeurige (d.w.z. single-molecule) karakterisering van de transcriptionele gebeurtenissen op DNA-breukplaatsen te leveren. Een belangrijke reden hiervoor was het gebrek aan geschikte experimentele hulpmiddelen. Celbestraling (γ-stralen, röntgenstralen, zware ionen) en medicamenteuze behandelingen (bijv. Topoisomeraseremmers of intercalerende middelen) missen ruimtelijke precisie en induceren DNA-laesies anders dan DSB’s, waaronder enkelstrengsbreuken en DNA-adducten8. Endonucleasen, zoals I-PpoI en AsiSI, genereren locus-specifieke DSB’s, maar zijn niet gecombineerd met een systeem dat gelijktijdige live-celvisualisatie van transcriptie op een enkele locus met hoge temporele precisie mogelijk maakt8. Om deze beperking te omzeilen, heeft ons lab het voortouw genomen bij de ontwikkeling van een reeks geavanceerde verslaggevers die transcriptie direct visualiseren met een resolutie van één molecuul bij de gecontroleerde inductie van een unieke DSB4. Hier beschrijven we deze verslaggevers, bieden we een gedetailleerd protocol voor live-cell imaging van transcriptie bij DSB’s en tonen we gegevens die transcriptie-initiatie onthullen bij een enkele DSB.
De reportergensystemen die in dit protocol worden gebruikt, zijn gebaseerd op het goed gekarakteriseerde muis IgM-reportergen en bevatten de exonen M1 en M2 van de membraangebonden vorm (μm) van de IgM-μ zware keten9,10,11. Een hybride intron scheidt de twee exonen met het sterke adenovirus major late transcript (AdML) PY tract12. De expressie van de reportergenen wordt gecontroleerd door de humane cytomegaloviruspromotor (CMV), waarin twee tandemkopieën van de Tet operator (TetO) sequentie zijn ingebracht. De reportergenen worden elk ingebracht in een plasmidevector die een Flp Recombination Target (FRT) -site bevat en ingevoegd in een specifieke FRT-doellocatie in het genoom van een HEK293-gastheercellijn. Deze cellijn brengt ook constitutief het Tet-repressoreiwit tot expressie om de expressie van het reporter-gen te reguleren via de aan- of afwezigheid van tetracycline / doxycycline. Om visualisatie van de transcriptie van het reportergen mogelijk te maken, werden 24 tandemherhalingen van de MS2-stamlussequentie en 24 tandemherhalingen van de PP7-stengellussequentie op verschillende posities ingebracht met betrekking tot transcriptiestartplaats en exon / intron-structuur van het reporter-gen. De MS2/PP7 RNA-stengellussen vormen zich bij transcriptie en zijn specifiek gebonden door ectopisch tot expressie gebrachte MS2/PP7-vachteiwitten gelabeld met groene en rode fluorescerende eiwitten, een strategie die veel werd gebruikt om transcriptie in beeld te brengen13,14,15. Daarnaast werd een enkele kopie van de 18 bp herkenningssequentie ingevoegd voor het homing endonuclease I-SceI dat direct wordt geflankeerd door de RNA stem-loop sequence arrays in de reporter genen. Standaard kloontechnieken werden gebruikt om alle plasmiden te genereren, het fragment met de I-SceI-24xMS2 stamlus van het PROP reporter gen werd gesynthetiseerd door een commerciële gensynthesedienst.
Het promotor-proximale DSB reporter gen (PROP) werd geconstrueerd door het inbrengen van de I-SceI snijplaats 45 basenparen (bp) stroomafwaarts van de vermeende transcriptie startplaats in exon I, gevolgd door 149 bp tot het begin van de 24x MS2 stem-loop cassette, die de novo was ontworpen met twee afwisselende niet-identieke stam-loop sequenties16 en nog eens vijf niet-repetitieve 20 bp spacersequenties om redundantie te verminderen. De MS2 stem-loop array wordt gevolgd door 72 bp tot het begin van de 1844 bp intron en de 1085 bp exon II tot de splitsings- en polyadenylation site. Het exon II codeert voor een cyaan fluorescerend eiwit (CFP) gefuseerd met een C-terminale peroxisomale targetingsequentie (PTS) van de humane peroxisomale acyl CoA-oxidase om een onafhankelijke screening van de reporter-genexpressie mogelijk te maken (figuur 1A).
Het exon II DSB reporter gen (EX2) bestaat uit een 167 bp exon I gevolgd door het intron en exon II dat codeert voor het CFP-PTS. Verder stroomafwaarts op een afstand van 169 bp werd een cassette met 24x MS2-steel-loops ingebracht, gevolgd door een linkersequentie van 84 bp met een I-SceI-site in het midden, gevolgd door 24x PP7-stengellussen en 221 bp tot de splitsings- en polyadenylation-site17 (figuur 1B).
Ten slotte is het exon II DSB reporter-gen met antisense transcription labeling (EX2AS) gebaseerd op het humane ubiquitine B (UBB) gentranscript UBB-201 en bevat het twee exonen en één intron. De exon I hebben een totale lengte van 1534 bp met een inverse insertie van de 24x MS2 stem-loop sequence. Daarom zal de juiste MS2 stem-loop RNA-sequentie worden getranscribeerd in een antisense richting met betrekking tot de zinstonranscriptie van het reporter-gen van de CMV-promotor. Het intron heeft een lengte van 490 bp, gevolgd door exon II met de I-SceI-site , en een coderend gebied werd ingevoegd voor twee in-frame ubiquitine-subeenheden. Stroomafwaarts van het UBB-gen bevindt zich een sequentie die een 24x PP7-stamlus vormt bij transcriptie van het reporter-gen in een bepaalde richting (figuur 1C).
De voorbijgaande transfectie van een induceerbare constructie van het homing endonuclease I-SceI maakt de gecontroleerde creatie van een DSB op de ingebrachte herkenningsplaats binnen elk reportergen mogelijk18. De I-SceI endonuclease is in beeld gefuseerd met het ligandbindende domein van de glucocorticoïde receptor en een verrood fluorescerend eiwit iRFP713. Dit construct is cytoplasmatisch in afwezigheid van triamcinolonacetonide (TA), maar migreert snel naar de kern na toevoeging van TA aan het groeimedium van de cellen (figuur 1D). De inductie van DSB’s door het I-SceI-systeem is robuust, zoals eerder aangetoond18,19,20. De transcriptie van het reporter-gen kan parallel worden gevolgd door de fluorescerend gelabelde RNA-stamlussystemen MS2 en PP7 te visualiseren.
Conflicten tussen essentiële biologische processen zoals replicatie, transcriptie, DNA-schade en DNA-reparatie zijn geïdentificeerd als een kritieke bron van genoominstabiliteit22. Deze studies hebben ook geleid tot de ontdekking van transcriptie op plaatsen van DNA-schade en hebben een functionele rol toegeschreven aan de door breuk geïnduceerde transcripten bij het reguleren van DNA-schadeherstelprocessen23. De nieuwe tools en het protocol dat hier wordt beschreven, maken verder onderzoek mogelijk naar de transcriptie van RNA Pol II bij DSB’s. Een kritiek punt in dit protocol is het genereren van cellijnen die een enkele kopie van het reporter-gen bevatten dat in het genoom is geïntegreerd. Deze belangrijke functie elimineert de ruis die wordt gecreëerd door de transcriptie van verschillende reportergenen geïntegreerd met meerdere kopieën binnen een enkele genomische locus en maakt het verzamelen van kinetische parameters van transcriptiedynamica en individuele RNA-transcripten mogelijk. Een cruciale technische vereiste om transcriptie van single reporter genintegraties te observeren, is de beschikbaarheid van een microscoopsysteem dat de detectie mogelijk maakt van enkele RNA-transcripten gelabeld met het MS2- of PP7-systeem in levende cellen4,12. Hier wordt live-cell microscopie uitgevoerd op een Confocal Spinning Disk-systeem gemonteerd op een omgekeerde microscoop, uitgerust met 100 mW solid-state lasers gekoppeld aan een akoestisch-optisch afstembaar filter zoals elders beschreven24. Bovendien, om transcriptie op een enkele DSB te bestuderen met behulp van de reporters, moeten individuele cellen zorgvuldig worden gecontroleerd om de hoogste tijdresolutie te bereiken, waarvoor beeldvormingscellen enkele uren nodig zijn, waardoor dit een test met lage doorvoer is. Toch observeren we verschillende cellen parallel aan de positionering die wordt geregeld door een piëzo-aangedreven microscooptrap. Om optimale omgevingsomstandigheden te garanderen voor observatie van levende cellen gedurende uren, wordt het microscooplichaam, inclusief de monsterfase, in een plexiglas omgevingskamer geplaatst. Bovendien is een gesloten fase incubatiekamer gemonteerd op de microscooptrap en aangesloten op CO2– en vochtigheidstoevoerregelaars.
De eerste cruciale stap in het protocol is de selectie van gebieden die van belang zijn met cellen voor beeldvorming. Elke XY-positie die voor beeldvorming is gemarkeerd, moet een of meer cellen bevatten die transfectie vertonen met de fluorescerende RNA-stamlusbindende eiwitten volgens het reportergen en transfectieschema beschreven in sectie 1, tabel 1, evenals in figuur 2D, E. Bovendien moeten de cellen helder gelabelde transcriptieplaatsen vertonen die samen met het I-SceI-GR-iRFP713-construct moeten worden getransfecteerd en moet het eiwit in eerste instantie in het cytoplasma worden gelokaliseerd (figuur 2D en E).
De cellen moeten een fluorescentie-intensiteitsniveau vertonen van ongebonden fluorescerend gelabeld MS2- en /of PP7-coatingeiwit dat laag genoeg is om enkele gelabelde transcripten over het achtergrondfluorescentieniveau te detecteren. Tegelijkertijd is een robuust fluorescentie-intensiteitsniveau van de fluorescerend gelabelde MS2- en / of PP7-coatingeiwitten nodig om beeldvorming gedurende ten minste 60 minuten mogelijk te maken zonder al te veel fluorescentie te verliezen als gevolg van wat bleken dat optreedt. De “Schaalbeeldweergave” met een vast bereik zoals beschreven in paragraaf 3.7 wordt gebruikt om een gestandaardiseerde selectie van cellen mogelijk te maken op basis van hun fluorescentie-intensiteitsniveau.
Een tweede kritieke protocolstap is het toevoegen van de TA aan de cellen op vooraf bepaalde XY-posities door het kleine gat in het deksel van de glazen bodemschaal. Elke manipulatie van de glazen bodemschaal zou een verschuiving van de gemarkeerde XY-positie van de cellen veroorzaken en moet worden vermeden. Daarom is het zorgvuldig hanteren van de micropipette tijdens het toevoegen van de TA verdund in het cellulaire groeimedium van vitaal belang voor de succesvolle observatie van vooraf geselecteerde cellen, zoals aangetoond in figuur 2F. De aanpassing van verschillende systemen om geneesmiddelen toe te voegen aan cellen die op een microscooptrap zijn gemonteerd, zoals een perfusiesysteem, zou een aparte fase-incubatiekamer vereisen met buisingang en uitgangen en een pomp- of injectiesysteem om geneesmiddelen toe te dienen. Andere methoden zoals kanaalglijbanen met coverslip-achtige bodemoppervlakken resulteren in een langzame diffusie van toegediende geneesmiddelen in het kanaal en veroorzaken een extra vertraging tussen toevoeging en effect van geneesmiddelen. Ten slotte kan onvoorzichtig pipetteren in een kanaalschuifopening ook de monsterpositie verschuiven. Daarom is het huidige systeem met een op maat geboord gat in het deksel van een schotel met glazen bodem eenvoudig aan te passen, goedkoop en geschikt voor het toedienen van verschillende groeimedia, medicijnen en componenten. De kleine diameter van het gat en de bevochtigde atmosfeer in de podiumincubatiekamer voorkomt ook uitdroging van het celmedium.
Een derde cruciale stap in dit protocol is de data-analyse, die een handmatige inspectie vereist van de tijdspunten waarop transcriptie stopt als gevolg van de inductie van een DSB. Het tijdstip van beëindiging van transcriptie wordt aangegeven door de laatste transcripties vrij te geven van de eerder heldere gelabelde site van de transcriptie van het reporter-gen. Evenzo moeten de gebeurtenissen van break-geïnduceerde transcriptie-initiatie met zorg worden geïnspecteerd om individuele transcriptiegebeurtenissen te detecteren met de relatief lage signaal-ruisverhouding van enkele fluorescerend gelabelde mRNA’s.
De dynamiek van reparatie van de geïnduceerde DSB voegt een extra laag complexiteit toe aan de analyses van gegevens die met behulp van deze verslaggevers worden gegenereerd, waardoor ze worden beperkt tot de eerste minuten onmiddellijk na inductie van de DSB. De transgene aard van reportergenen en de herhalingsrijke aard van de MS2- en PP7-stamlusarrays kunnen een uniek chromatinelandschap samenstellen, waardoor vermoedelijk stabiele break-geïnduceerde transcriptieprogramma’s worden verstoord. Niettemin, in vergelijking met ioniserende of UV-bestraling, is de I-SceI gemedieerde inductie van een DSB in reportergenen een veel robuuster systeem om transcriptie bij individuele DB’s te onderzoeken.
Verschillende endonucleasesystemen zoals I-CreI, I-PpoI of AsiSI die al dan niet extra herkenningsplaatsen in het menselijk genoom hebben, kunnen worden gecombineerd met de huidige reporter-gensystemen voor een mogelijk hogere efficiëntie van het genereren van DSB’s. Ze vereisen echter eerst de endonucleaseherkenningsplaats in de reportergenen. Ten tweede kunnen ze een vergelijkbare variabiliteit hebben op de timing en efficiëntie-inductie van een DSB in individuele cellen. Aan de andere kant kan het invoegen van tandemkopieën van endonucleaseherkenningsplaatsen de efficiëntie van DSB-inductie verhogen. Bovendien zou het testen van de gepresenteerde reporter-gensystemen in verschillende cellijnen de vergelijking van transcriptiedynamiek op DSB-locaties tussen verschillende cellulaire achtergronden en de beschikbaarheid van verschillende DNA-schadeherstelroutes zoals in kankercellen, primaire cellen en gedifferentieerde niet-fietsende cellen mogelijk maken. De constructie van de reportergenen om compatibel te zijn met het Flp/FRT-systeem beperkt momenteel echter de integratie in beschikbare Flp/FRT-gastheercellijnen.
Naast op microscopie gebaseerde toepassingen kunnen de huidige reportergenen ook worden gecombineerd met biochemische assays, zoals chromatine-immunoprecipitatie, om de rekrutering van DNA-reparatie- of transcriptiefactoren voor een enkele DSB te bestuderen of om de bezetting van nucleosoom, histonmodificaties en chromatinetoestand rond de DSB-site te beoordelen. Bovendien zou een combinatie met verschillende reportersystemen de studie van functionele verbanden tussen DNA-schade en processen zoals genoomorganisatie of DNA-replicatie mogelijk maken.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca voor geschenken van plasmiden en reagentia. We zijn ook dank verschuldigd aan de medewerkers van de iMM Bioimaging Facility, A. Temudo, A. Nascimento en J. Rino, voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 en PTDC/MED-OUT/4301/2020 van Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal en door LISBOA-01-0145-FEDER-007391, project medegefinancierd door FEDER via POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa en FCT. Er is ook financiering ontvangen uit het EU-programma voor onderzoek en innovatie Horizon 2020 (RiboMed 857119). MA is de ontvanger van de FCT Ph.D. fellowship 2020.05899.BD.
100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
DMEM | Gibco | 41966029 | |
DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
FBS | Gibco | 10270106 | |
Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |