يقدم هذا البروتوكول نظام جين مراسل جديد والإعداد التجريبي للكشف عن النسخ في فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي مع حساسية جزيء واحد.
فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي (DSB) هي النوع الأكثر حدة من تلف الحمض النووي. على الرغم من العواقب الكارثية على سلامة الجينوم ، فإنه لا يزال بعيد المنال حتى الآن كيف تؤثر DSBs على النسخ. وكان السبب في ذلك هو عدم وجود أدوات مناسبة لرصد النسخ في وقت واحد وتحريض DSB genic مع دقة زمنية ومكانية كافية. يصف هذا العمل مجموعة من المراسلين الجدد الذين يتصورون النسخ مباشرة في الخلايا الحية مباشرة بعد تحريض DSB في قالب الحمض النووي. وتستخدم البكتيريا الحمض النووي الريبي الجذعية الحلقات لرصد النسخ مع حساسية جزيء واحد. لاستهداف DSB إلى منطقة جين محددة ، تم تصميم جينات المراسل لاحتواء تسلسل اعتراف واحد من الإندونوكلياز I-SceI ، غائبة عن الجينوم البشري. تم دمج نسخة واحدة من كل جين مراسل في جينوم خطوط الخلايا البشرية. يسمح هذا النظام التجريبي بالكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي المفردة الناتجة عن النسخ الجيني الكنسي أو عن طريق بدء النسخ الناجم عن كسر الحمض النووي. يوفر هؤلاء المراسلون فرصة غير مسبوقة لتفسير التفاعلات المتبادلة بين النسخ وتلف الحمض النووي والكشف عن جوانب غير مقدرة حتى الآن من النسخ الناجم عن كسر الحمض النووي.
فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي (DSBs) هي آفات الحمض النووي السامة التي تعطل وظيفة الخلية وتساهم في تمرد العديد من الأمراض والشيخوخة1. الطفرات الناتجة عن إصلاح غير دقيق للDSBs تؤثر على التعبير الجيني ووضع الأساس للانخفاض الوظيفي للخلية. ويشير الرأي الناشئ بأن مركبات DSBs تقود النسخ الناجم عن كسر نوفو في موقع الآفة2،3،4،5،6،7 إلى أن DSBs قد تؤثر أيضا على الوظيفة الخلوية من خلال الرنانات الناجمة عن الكسر. وتشير عدة دراسات حديثة إلى أن مركبات ثنائي الفينيل متعددة المستويات كافية لبدء النسخ المبرمج (على سبيل المثال، في الجينات غير القابلة للانزكزاز) والنسخ غير المجدول (على سبيل المثال، لدى المروجين غير الكنسيين)4,5,7. ومع ذلك ، على الرغم من العديد من الدراسات التي تستكشف الروابط بين تلف الحمض النووي والنسخ ، لا يزال الحقل متخلفا في قدرته على تقديم توصيف دقيق (أي جزيء واحد) للأحداث النسخية في مواقع كسر الحمض النووي. وكان أحد الأسباب الهامة لذلك هو عدم وجود أدوات تجريبية مناسبة. إن تشعيع الخلايا (أشعة γ، والأشعة السينية، والأيونات الثقيلة)، والعلاجات الدوائية (مثل مثبطات توبويسوميراز أو عوامل التوليل) تفتقر إلى الدقة المكانية وتحفز آفات الحمض النووي غير مركبات ثنائي الفينيل متعددة الخلايا، بما في ذلك فواصل الخيط الواحد ووكلاء الحمض النووي8. تولد الخلايا الإندونوكلية، مثل I-PpoI و AsiSI، DSBs خاصة بالجراد ولكن لم يتم دمجها مع نظام يسمح بالتصور المتزامن للخلايا الحية للنسخ في مكان واحد بدقة زمنية عالية8. لتجاوز هذا القيد، قاد مختبرنا تطوير مجموعة من المراسلين المتطورين الذين يتصورون النسخ مباشرة بدقة جزيء واحد عند الحث الخاضع للرقابة ل DSB4 فريدة من نوعها. هنا، نصف هؤلاء المراسلين، ونقدم بروتوكولا مفصلا لتصوير النسخ بالخلايا الحية في DSBs ونعرض البيانات التي تكشف عن بدء النسخ في DSB واحد.
تستند أنظمة الجينات المراسل المستخدمة في هذا البروتوكول على الجين مراسل IgM الماوس تتميز جيدا وتحتوي على exons M1 و M2 من شكل غشاء ملزمة (μm) من IgM μ سلسلة ثقيلة9,10,11. فصل intron الهجين exons اثنين مع نص قوي adenovirus الرئيسية في وقت متأخر (AdML) PY tract12. يتم التحكم في التعبير عن جينات المراسل من قبل مروج الفيروس المضخم للخلايا البشري (CMV) ، حيث تم إدخال نسختين مترادفتين من تسلسل مشغل تيت (TetO). يتم إدخال جينات المراسل في ناقل بلازميد يحتوي على موقع هدف إعادة دمج Flp (FRT) وإدراجها في موقع مستهدف محدد ل FRT في جينوم خط الخلية المضيف HEK293. هذا الخط الخلية يعبر أيضا بشكل تأسيسي البروتين قمع تيت لتنظيم التعبير عن الجين مراسل عن طريق وجود أو عدم وجود التتراسيكلين / دوكسيسيكلين. وللسماح بتصور النسخ الجيني للمراسل، تم إدراج 24 تكرارا مترادفا لتسلسل الحلقة الجذعية MS2 و24 تكرارا مترادفا لتسلسل الحلقة الجذعية PP7 في مواقع مختلفة فيما يتعلق بموقع بدء النسخ وهيكل exon/intron لجين المراسل. تتشكل الحلقات الجذعية من MS2/PP7 RNA عند النسخ وترتبط على وجه التحديد ببروتينات معطف MS2/PP7 المعبر عنها خارج الرحم الموسومة بالبروتينات الفلورية الخضراء والحمراء ، وهي استراتيجية تستخدم على نطاق واسع من قبل لتصوير النسخ13،14،15. بالإضافة إلى ذلك، تم إدراج نسخة واحدة من تسلسل التعرف على 18 bp لedonuclease توجيه I-SceI التي تحيط بها مباشرة صفائف تسلسل حلقة الجذعية الحمض النووي الريبي في الجينات مراسل. واستخدمت تقنيات الاستنساخ القياسية لتوليد جميع البلازميدات، وتم توليف الجزء الذي يحتوي على حلقة الجذعية I-SceI-24xMS2 من جين مراسل PROP بواسطة خدمة توليف الجينات التجارية.
تم بناء الجين مراسل DSB المروج القريبة (PROP) عن طريق إدراج موقع القطع I-SceI 45 أزواج قاعدة (bp) المصب من موقع بدء النسخ المفترض في exon I، تليها 149 bp حتى بداية كاسيت حلقة الجذعية MS2 24x، الذي تم تصميمه دي نوفو مع اثنين من تسلسل حلقة الجذعية غير متطابقة بالتناوب16 وخمسة إضافية غير المتكررة 20 بت تسلسل المسافة للحد من التكرار. يتبع صفيف حلقة الجذعية MS2 72 نقطة أساس حتى بداية intron 1844 bp و 1085 bp exon II حتى موقع الانقسام والتعددية. يقوم exon II بترميز بروتين فلوري سماوي (CFP) منصهر في تسلسل استهداف بيروكسيسومال C-terminal (PTS) من أوكسيداز أسيل بيروسومال الإنسان للسماح بفحص مستقل للتعبير الجيني للمراسل (الشكل 1A).
الجين مراسل EXON II DSB (EX2) يتكون من exon 167 bp أنا تليها intron و exon II ترميز CFP-PTS. وفي اتجاه مجرى النهر على مسافة 169 نقطة أساس، تم إدخال كاسيت يحتوي على حلقات جذعية 24x MS2، يليه تسلسل وصلة 84 نقطة أساس مع موقع I-SceI في الوسط، يليه حلقات جذعية 24x PP7 و221 نقطة أساس حتى موقع الانقسام والتعددية 17 (الشكل 1B).
وأخيرا ، فإن الجين مراسل EXON II DSB مع وضع العلامات النسخ المضادة (EX2AS) يستند إلى نص الجين UBB-201 في كل مكان B (UBB) البشري ويحتوي على اثنين من exons وintron واحد. exon لدي طول إجمالي قدره 1534 نقطة أساس مع إدراج عكسي من 24x MS2 الجذعية حلقة التسلسل. لذلك ، سيتم نسخ تسلسل الحمض النووي الريبي الصحيح MS2 stem-loop في اتجاه مضاد فيما يتعلق بالنسخ المنطقي لجين المراسل من مروج CMV. يبلغ طول الإنترون 490 نقطة أساس، يليه exon II مع موقع I-SceI ، وتم إدراج منطقة ترميز لوحدات فرعية في كل مكان داخل الإطار. المصب من الجين UBB هو التسلسل الذي يشكل 24x PP7 الجذعية حلقة عند نسخ الجين مراسل في اتجاه المعنى (الشكل 1C).
يسمح التحويل العابر للبناء غير القابل للاختزال ل I-SceI بالتحكم في إنشاء DSB في موقع التعرف المدرج داخل كل جين مراسل18. يتم دمج الإندونوكليز I-SceI في الإطار مع المجال الملزم لليجند لمستقبلات الجلوكوكورتيكويد وبروتين فلوري أحمر بعيد iRFP713. هذا البناء هو السيتوبلازمية في غياب الأسيتونيد تريامسينولون (TA) ولكن يهاجر بسرعة إلى النواة عند إضافة TA إلى متوسط النمو للخلايا (الشكل 1D). إن تحريض DSBs من قبل نظام I-SceI قوي ، كما هو موضح قبل 18،19،20. ويمكن رصد النسخ الجيني للمراسل بالتوازي من خلال تصور أنظمة الحمض النووي الريبي الموسومة بالفلورسنت MS2 و PP7.
وقد تم تحديد الصراعات بين العمليات البيولوجية الأساسية مثل النسخ المتماثل والنسخ وتلف الحمض النووي وإصلاح الحمض النووي كمصدر حاسم لعدم استقرار الجينوم22. وقد أدت هذه الدراسات أيضا إلى اكتشاف النسخ في مواقع تلف الحمض النووي وعزت دورا وظيفيا إلى النصوص الناجمة عن الكسر في تنظيم عمليات إصلاح تلف الحمض النووي23. تسمح الأدوات الجديدة والبروتوكول الموصوف هنا بإجراء مزيد من التحقيق في ديناميكيات نسخ الحمض النووي الريبي Pol II في DSBs. ومن النقاط الحاسمة في هذا البروتوكول توليد خطوط الخلايا التي تحتوي على نسخة واحدة من جين المراسل المدمج في الجينوم. هذه الميزة الرئيسية يزيل الضوضاء الناجمة عن نسخ العديد من الجينات مراسل متكاملة مع نسخ متعددة داخل مكان الجينوم واحد ويسمح بجمع المعلمات الحركية من ديناميات النسخ والنصوص الحمض النووي الريبي الفردية. ومن المتطلبات التقنية الحاسمة لمراقبة نسخ التكامل الجيني لمراسل واحد هو توافر نظام المجهر الذي يسمح بالكشف عن نصوص الحمض النووي الريبي المفرد المسمى بنظام MS2 أو PP7 في الخلايا الحية4,12. هنا، يتم إجراء المجهر الحي الخلية على نظام قرص الغزل Confocal محمولة على المجهر مقلوب، ومجهزة 100 كيلوواط ليزر الحالة الصلبة إلى جانب مرشح الصوتية البصرية غير قادر على النحو المبين في مكان آخر24. وعلاوة على ذلك، لدراسة النسخ في DSB واحد باستخدام المراسلين، يجب مراقبة الخلايا الفردية بعناية لتحقيق أعلى دقة الوقت، الأمر الذي يتطلب خلايا التصوير لعدة ساعات، مما يجعل هذا المقايسة الإنتاجية منخفضة. ومع ذلك ، نلاحظ العديد من الخلايا بالتوازي مع تحديد المواقع التي تسيطر عليها مرحلة المجهر التي تحركها بيزو. لضمان الظروف البيئية المثلى لمراقبة الخلايا الحية على مدى ساعات، يتم وضع جسم المجهر، بما في ذلك مرحلة العينة، داخل غرفة بيئية زجاجية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تركيب غرفة حضانة مرحلة مغلقة على مرحلة المجهر وتوصيلها بوحدات التحكم في إمدادات ثاني أكسيد الكربون والرطوبة.
الخطوة الحاسمة الأولى في البروتوكول هي اختيار المناطق ذات الاهتمام مع الخلايا للتصوير. يجب أن يحتوي كل موضع XY الذي تم وضع علامة عليه للتصوير على خلية واحدة أو أكثر تظهر العدوى مع بروتينات الربط الحلقي الجذعية الحمض النووي الريبي الفلوري وفقا لمخطط الجينات والإصابة بالمراسل الموصوف في القسم 1 ، الجدول 1 ، وكذلك في الشكل 2D ، E. وعلاوة على ذلك، يجب أن تظهر الخلايا مواقع النسخ المسماة مشرق يجب أن تكون مشتركة مع بناء I-SceI-GR-iRFP713، ويجب أن يتم توطين البروتين في البداية في السيتوبلازم (الشكل 2D و E).
يجب أن تظهر الخلايا مستوى كثافة مضان من MS2 الموسومة بالفلورسنت غير المنضم و / أو بروتين معطف PP7 منخفض بما يكفي للكشف عن النصوص ذات العلامات المفردة على مستوى الفلورية الخلفية. وفي الوقت نفسه، من الضروري وجود مستوى قوي من كثافة الفلورسنت لبروتينات معطف MS2 و/أو PP7 الموسومة بفلورسنت للسماح بالتصوير على مدى 60 دقيقة على الأقل دون فقدان الكثير من الفلورسنت بسبب بعض التبييض الذي يحدث. يتم استخدام “عرض صورة المقياس” مع نطاق ثابت كما هو موضح في القسم 3.7 للسماح باختيار موحد للخلايا وفقا لمستوى كثافة الفلورسينس.
خطوة البروتوكول الحرجة الثانية هي إضافة TA إلى الخلايا على مواقع XY المحددة مسبقا من خلال ثقب صغير في غطاء طبق القاع الزجاجي. أي تلاعب في طبق أسفل الزجاج من شأنه أن يسبب تحولا من موقف XY ملحوظ من الخلايا ويجب تجنبها. لذلك ، فإن التعامل بعناية مع micropipette مع إضافة TA المخفف في وسيط النمو الخلوي أمر حيوي لمراقبة ناجحة للخلايا المختارة مسبقا ، كما هو موضح في الشكل 2F. وسيتطلب تكييف نظم مختلفة لإضافة أدوية إلى الخلايا المثبتة على مرحلة المجهر، مثل نظام التشوه، غرفة حضانة مرحلة منفصلة مع فتحات مدخل أنبوب وخروج ومضخة أو نظام حقن لإدارة المخدرات. وتؤدي طرق أخرى مثل شرائح القناة ذات الأسطح السفلية الشبيهة بالأغطية إلى الانتشار البطيء للأدوية الخاضعة للإدارة في القناة وتسبب تأخيرا إضافيا بين إضافة الأدوية وتأثيرها. وأخيرا، قد يؤدي الأنابيب غير الحذرة إلى فتح شريحة قناة إلى تغيير موضع العينة أيضا. لذلك ، فإن النظام الحالي مع ثقب حفر مخصص في غطاء طبق زجاجي القاع واضح للتكيف ، ومنخفض التكلفة ، ومناسب لإدارة وسائل الإعلام المختلفة للنمو والأدوية والمكونات. القطر الصغير للثقب والغلاف الجوي المرطب في غرفة حضانة المرحلة يمنع أيضا الجفاف من وسط الخلية.
والخطوة الحاسمة الثالثة في هذا البروتوكول هي تحليل البيانات، الذي يتطلب تفتيشا يدويا للنقاط الزمنية التي يتوقف فيها النسخ بسبب تحريض جهاز DSB. يشار إلى النقطة الزمنية لإنهاء النسخ من خلال إصدار النصوص الأخيرة من الموقع المسمى سابقا مشرق من النسخ الجيني المراسل. وبالمثل، يجب فحص أحداث بدء النسخ الناجم عن الكسر بعناية للكشف عن أحداث النسخ الفردية مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء المنخفضة نسبيا من الرنانات المفردة المسماة بالفلورسنت.
وتضيف ديناميات إصلاح ال DSB المستحث طبقة إضافية من التعقيد إلى تحليلات البيانات المتولدة باستخدام هؤلاء المراسلين، مما يحد منها بالدقائق الأولى مباشرة بعد تحريض DSB. قد تجمع الطبيعة المعدلة وراثيا لجينات المراسل والطبيعة الغنية المتكررة للصفائف الحلقية الجذعية MS2 و PP7 مشهدا فريدا من الكروماتين ، مما يتعارض مع إنشاء برامج نسخ مستقرة مفترضة ناتجة عن الكسر. ومع ذلك ، بالمقارنة مع التأين – أو الأشعة فوق البنفسجية ، وI – SceI بوساطة التعريفي من DSB في الجينات مراسل هو نظام أكثر قوة للتحقيق في النسخ في DSBs الفردية.
يمكن الجمع بين أنظمة الإندونوكليز المختلفة مثل I-CreI أو I-PpoI أو AsiSI التي لديها أو ليس لديها مواقع اعتراف إضافية داخل الجينوم البشري مع أنظمة الجينات المراسلة الحالية لتحقيق كفاءة أعلى محتملة لتوليد DSBs. ومع ذلك ، فإنها تتطلب أولا إدخال موقع التعرف على الإندونوكليا في جينات المراسل. ثانيا، قد يكون لديهم تباين مماثل في توقيت وكفاءة التعريفي من DSB في الخلايا الفردية. من ناحية أخرى، قد يؤدي إدخال نسخ مترادفة من مواقع التعرف على الإندونوكلياز إلى زيادة كفاءة تحريض DSB. وعلاوة على ذلك، فإن اختبار أنظمة الجينات المراسل المعروضة في خطوط الخلايا المختلفة من شأنه أن يسمح بالمقارنة بين ديناميات النسخ في مواقع DSB بين الخلفيات الخلوية المختلفة وتوافر مسارات مختلفة لإصلاح تلف الحمض النووي كما هو الحال في الخلايا السرطانية والخلايا الأولية والخلايا غير الدراجاتية المتباينة. ومع ذلك ، فإن بناء الجينات مراسل لتكون متوافقة مع نظام Flp / FRT حاليا الحد من الاندماج في خطوط الخلية المضيفة Flp / FRT المتاحة.
بالإضافة إلى التطبيقات المستندة إلى المجهر ، يمكن أيضا دمج جينات المراسل الحالي مع المقايسات الكيميائية الحيوية ، مثل التحلل المناعي للكروماتين ، لدراسة توظيف عوامل إصلاح الحمض النووي أو النسخ إلى DSB واحد أو لتقييم إشغال النيوكليوسوم ، وتعديلات الهستون ، وحالة الكروماتين حول موقع DSB. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع مع نظم المراسلات المختلفة من شأنه أن يسمح بدراسة الروابط الوظيفية بين تلف الحمض النووي وعمليات مثل تنظيم الجينوم أو تكرار الحمض النووي.
The authors have nothing to disclose.
نشكر RH Singer، J.A. Chao، T. Misteli، M. كارمو فونسيكا لهدايا من البلازميدات والكواشف. ونحن مدينون أيضا لموظفي مرفق التصوير الحيوي التابع ل iMM، أ. تيمودو، أ. ناسيمنتو، وجي رينو، بقراءة المخطوطة بشكل نقدي. تم تمويل هذا العمل من قبل PTDC/MED-OUT/32271/2017، PTDC/BIA-MOL/30438/2017 وPTDC/MED-OUT/4301/2020 من فونداساو بارا A Ciência e a Tecnologia (FCT)، البرتغال ومن LISBOA-01-0145-FEDER-007391، مشروع بتمويل مشترك من فيدر من خلال بور ليسبوا، البرتغال 2020-Programa الأوبرالية الإقليمية دي لشبونة، وFCT. كما تم تلقي التمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار (RiboMed 857119). حاصل على زمالة دكتوراه FCT 2020.05899.BD.
100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
DMEM | Gibco | 41966029 | |
DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
FBS | Gibco | 10270106 | |
Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |