Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
La identificación de los eventos de controlador funcionales en el cáncer es central para la promoción de nuestra comprensión de la biología del cáncer y indispensable para el descubrimiento de la próxima generación de nuevas dianas farmacológicas. Cada vez es más evidente que se requieren modelos más complejos de cáncer de apreciar plenamente los factores que contribuyen que conducen a la tumorigénesis in vivo e incrementan la eficacia de las terapias innovadoras que hacen la transición de modelos preclínicos para ensayos clínicos.
Aquí presentamos una metodología para la generación de esferoides tumorales uniformes y reproducibles que puede ser sometido a cribado funcional de siRNA. Estos esferoides presentan muchas de las características que se encuentran en los tumores sólidos que no están presentes en el cultivo tradicional de dos dimensiones. Se demuestra que varias líneas celulares de cáncer de mama comúnmente utilizados son susceptibles de este protocolo. Además, proporcionamos la prueba de principio de los datos que utilizan el cáncer de mama BT474 línea celular, lo que confirma sudependencia de la amplificación del factor de crecimiento epidérmico receptor HER2 y la mutación de la fosfatidilinositol-4,5-bifosfato 3-quinasa (PIK3CA) cuando se cultiva como esferoides tumorales. Por último, estamos en condiciones de investigar más a fondo y confirmar el impacto espacial de estas dependencias mediante inmunohistoquímica.
Los tumores sólidos muestran significativa histológico, la heterogeneidad intra-tumor genética y micro-ambiental, que presenta a los médicos un desafío significativo en la capacidad de tratar a los pacientes con éxito. La mayoría de los modelos utilizados para identificar terapias novedosas no incorporan muchas de estas características. De hecho, las terapias dirigidas actuales utilizados en la clínica se han desarrollado en la última década empleando enfoques de detección que se basan en líneas celulares de cáncer cultivadas bajo condiciones (2D) de cultivo de dos dimensiones. Aunque esto ha dado lugar a varios éxitos, como los inhibidores de la tirosina quinasa del receptor, cada vez es evidente que se requieren modelos más complejos de cáncer de apreciar plenamente los factores que contribuyen que conducen a la tumorigénesis in vivo e incrementan el número de nuevas terapias que hacen la transición de modelos preclínicos a los ensayos clínicos. Por otra parte, ahora se aprecia bien que los sistemas de cultivo 2D no reflejan trcomportamiento in vivo 1,2. Por ejemplo, en tumores vascularizados mal, ya que la demanda de oxígeno y nutrientes en el microambiente superar a la oferta, las regiones de las entregas de alta y baja se desarrollan. La presencia de bajos niveles de oxígeno (hipoxia) en los tumores, tal como se detecta por la tinción inmunohistoquímica de secciones tumorales hipóxicas para los marcadores establecidos, como la anhidrasa carbónica IX (CAIX), se correlaciona con una peor evolución clínica en el cáncer de mama 3,4 características Así que incorporan tales como hipoxia en los modelos de detección puede mejorar nuestra capacidad de descubrir nuevos objetivos farmacológicos que sean más eficaces in vivo. De hecho, dirigidos con éxito tumores agresivos que contienen la hipoxia es una prioridad clínica 5.
La alteración de la detección tradicional 2D siRNA, en un intento de recapitular con mayor precisión los elementos de las condiciones encontradas por las células cancerosas en el microambiente tumoral, ha llevado a la identificación de varios genes THa se han encontrado para ser importante para el crecimiento del tumor in vivo. Estos incluyen pantallas de genómica funcional realizados en condiciones de bajo suero 6, 7 y condiciones de hipoxia en combinación 8. Por ejemplo, el silenciamiento de 6-fosfofructo-2-quinasa / fructosa-2,6-bifosfatasa 4 (PFKFB4), una proteína responsable de la regulación de la glicolisis de entrar de carbono, solamente induce la apoptosis en líneas de cáncer de próstata derivadas de metástasis cuando se cultiva en suero bajo. El silenciamiento de PFKFB4 en líneas de células de próstata normales en las mismas condiciones no tuvo ningún efecto, mientras que, el agotamiento de PFKFB4 ablación completamente el crecimiento de la línea celular de cáncer de próstata xenoinjertos 6.
En un grupo ampliado de líneas celulares de cáncer de mama, el silenciamiento de transportador de mono-carboxilasa 4 (MCT4) preferentemente condujo a la reducción del crecimiento de la línea celular bajo condiciones de bajo nivel de oxígeno. Esta vulnerabilidad se validó in vivo en el cáncer de mama línea celular xenogra ortotrópicoFTS. número Quizás lo más sorprendente es que el silenciamiento de acetil-CoA sintetasa 2 (ACSS2), una enzima responsable de la conversión de acetato en acetil-CoA, la reducción de cáncer de células bajo condiciones de estrés de nutrientes (bajo nivel de oxígeno y suero), pero tuvo poco o ningún efecto en condiciones normales de cultivo 8. La ablación de ACSS2 afectado el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de mama y de próstata que sugieren que los gradientes de nutrientes no existen en forma aislada en el microambiente tumoral y que las células que residen en estas regiones son esenciales para la progresión del tumor 8. Además, ACSS2 también se encontró que era importante en glioblastoma y carcinomas hepatocelulares 9,10, lo que sugiere que el aumento de la actividad ACSS2 en los tumores podría ser un mecanismo fundamental que apoya el crecimiento en condiciones desfavorables.
En conjunto, estos estudios demuestran que la recapitulación de las condiciones encontradas in vivo y la realización de pantallas de siRNA permite la identificación de genes esenciales para la supervivencia del cáncer. Además de afectar el crecimiento celular del cáncer de 2D en condiciones de estrés de nutrientes, el agotamiento de los genes diana en estos estudios inhibida línea celular de crecimiento esferoide cáncer, reflejo de lo que se observó en xenoinjertos de tumor de 6,8. Por lo tanto, esferoides línea celular de cáncer contienen varias de las condiciones encontradas en el microambiente tumoral que imparten sensibilidad a silenciamiento ACSS2. De hecho, esferoides muestran gradientes de nutrientes (suero y oxígeno), cambios en el pH, (3D) de contacto célula-célula tridimensional, sino también, las alteraciones en la celeridad proliferativa con las células sometidas a la detención del ciclo celular y la apoptosis. Ejemplo de ello es la presencia de esferoides de cáncer de regiones necróticas, una característica que no se encuentra en la cultura tradicional en 2D.
esferoides celulares de cáncer ya han sido utilizados como modelos más biológicamente relevantes para detectar inhibidores de moléculas pequeñas pero esto sólo permite la validación de la eficacia del compuesto o la reutilización de compounds originalmente diseñar para otras enfermedades 11. métodos de cribado esferoide actuales no permiten el análisis de agotamiento gen específico en un alto rendimiento de forma de alta contenido. A continuación, describimos por primera vez, una tubería de genómica funcional para descubrir dependencias de genes específicos que utilizan tecnología de pequeños ARN de interferencia (siRNA) en el cáncer de líneas celulares esferoides. Hemos diseñado una biblioteca a medida con siRNAs dirigidos a los 200 genes mutados con mayor frecuencia en los cánceres de mama humanos y evaluamos los efectos del agotamiento de genes en el tamaño del esferoide y la actividad metabólica en BT474 esferoides de cáncer de mama. Hemos sido capaces de detectar robusta y reproducible el impacto de ErbB2 y PIK3CA silenciar en 3D culturas. Por otra parte, se podría evaluar el impacto del agotamiento del gen de la arquitectura espacial de esferoides BT474 mediante inmunohistoquímica.
Los modelos tridimensionales de cáncer se están empleando cada vez más para evaluar la eficacia de los compuestos conocidos y nuevos que se han diseñado para matar selectivamente células cancerosas. Esferoides celulares de cáncer son estructuras que muestran condiciones más similares a los encontrados en los tumores in vivo, por lo tanto compuestos que han aumentado la eficacia en 3D son más propensos a tener un efecto in vivo. Sin embargo, estas modalidades no permiten la identificación de dianas potencialmente nuevos que no han sido objeto de diseño de fármacos que podrían tener una eficacia considerable en el tratamiento de cáncer.
Hemos desarrollado un enfoque de la genómica funcional de siRNA que permitió el silenciamiento de genes duradera hasta por siete días en el cáncer de líneas celulares esferoides. Hay varios pasos críticos en el protocolo que requieren optimización antes de una pantalla de siRNA se puede realizar. La capacidad de formar esferoides viables reproducibles a gran escala es esencial. Por otra parte, unatransfección condiciones apropiadas, con deben ser rigurosamente optimizados. Sugerimos probando varios diferentes reactivos de transfección con la no adecuada focalización y matando a los controles antes de intentar la pantalla. Hemos sido capaces de demostrar que varias líneas celulares de cáncer de mama de uso común, a saber, BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 y JIMT1 eran susceptibles de siRNA transfección. Además, proporcionamos la prueba de principio de cribado de los 200 genes más frecuentemente mutados en el cáncer de mama en esferoides BT474 datos, confirmó su dependencia de amplificación de HER2 y la mutación oncogénica de PIK3CA. Curiosamente, el silenciamiento de la FOXO3 factor de transcripción resultó en una reducción en el tamaño de esferoides, pero no tiene efecto significativo sobre la viabilidad. FOXO3 se sabe que regulan la respuesta a la hipoxia, la alteración de la capacidad metabólica de las células cancerosas que les permite adaptarse más fácilmente a su entorno 16. Esta función podría interferir potencialmente con la lectura de la viabilidad celular ya que detecta la abundancia ATP, Uno de los principales productos de metabolismo celular.
En apoyo de la observación de una reducción en el tamaño de esferoides, se ha demostrado que el silenciamiento de FOXO3 en HeLa xenoinjertos de retraso del crecimiento del tumor y la apoptosis inducida por 17. Es importante tener en cuenta que algunos genes pueden afectar la capacidad de las células cancerosas para mantener su arquitectura 3D, lo que podría dar lugar a falsos positivos. Por ejemplo, desmontables de E-cadherina dio lugar a la disolución de la estructura esferoidal BT474. Esto se había informado anteriormente utilizando E-cadherina dirigido anticuerpos 18. Como con cualquier plataforma de cribado, objetivos potenciales deben ser controlados de nuevo para evaluar la reproducibilidad del efecto observado. Existen limitaciones en la técnica, a saber, la naturaleza transitoria del gen desmontables siRNA mediada. Sostenidas silenciar a más de siete días no era alcanzable con siRNA.
La ventaja de este enfoque es que se puede acoplar con varios otros biomascolorantes tric no sólo a aquellos que valoran la viabilidad esferoide, por ejemplo, dar información espacial de la hipoxia esferoides o monitoreo células que experimentan apoptosis. Por otra parte, debido a que las exploraciones lector de placas son relativamente rápido y no invasivo, el impacto de siRNAs en el tamaño del esferoide se puede evaluar con el tiempo en lugar de sólo en el punto final experimental. De hecho, estamos explorando actualmente varias de estas vías dentro de nuestra línea de proyección. Un enfoque alternativo que utiliza cultivos 3D para identificar nuevos dependencias es el uso de bibliotecas químicas que inhiben cualquiera de una amplia gama de objetivos o familias particulares de proteínas. De hecho, Bitler et al. utilizado este enfoque específico para identificar la interacción entre el estado de letalidad sintética ARID1A y los inhibidores de EZH2 en los carcinomas de células claras de ovario 19. El descubrimiento de la tecnología de edición gen CRISPR-Cas9 también ha permitido el desarrollo de las pantallas de genética en cultivos de organoides como in vivo. Sin embargo, tsu enfoque depende de tener instalaciones adecuadas para los animales y puede tener un costo prohibitivo 20.
En conclusión, creemos que hemos esbozado un protocolo que los modelos con mayor precisión el oxígeno y nutrientes gradientes, que son características del microambiente del tumor in vivo, lo que permite la identificación de nuevas dianas para el cáncer o la validación robusta de los objetivos establecidos. Por otra parte, el protocolo se puede aplicar a cualquier tipo de línea celular que forma esferoides y por lo tanto puede ser utilizado de forma rutinaria en la comunidad de investigación del cáncer para las pantallas de siRNA de alto rendimiento.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
Celigo S | Nexcelom | contact company | |
Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
Benchtop centrifuge | Various | ||
Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
Mulitichannel pipette | Various |