Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
癌における機能ドライバイベントの同定は、新規な薬物標的の次の世代の発見のための癌生物学の我々の理解を促進する中心的かつ不可欠です。癌のより複雑なモデルは、in vivoで腫瘍形成を駆動し、臨床試験への前臨床モデルからの移行を行う新しい治療法の有効性を増加させる要因を完全に理解することが必要であることが明らかになってきています。
ここでは、siRNA機能的スクリーニングに供することができる均一で再現性の腫瘍スフェロイドを生成するための方法論を提示します。これらのスフェロイドは、従来の2次元培養物中に存在していない固形腫瘍で発見された多くの特徴を表示します。我々は、いくつかの一般的に使用される乳癌細胞株は、このプロトコルに適していることを示しています。さらに、我々はそれらを確認し、乳癌細胞系BT474を用いたプルーフの原理データを提供します上皮成長因子受容体HER2およびホスファチジルイノシトール-4,5-ビホスフェート3-キナーゼ(PIK3CA)の変異の増幅に依存する腫瘍スフェロイドとして増殖させました。最後に、我々はさらに、免疫組織化学を使用して、これらの依存関係の空間的影響を調査し、確認することができます。
固形腫瘍は、正常患者を治療することができることで重要な課題で臨床医を提示する重要な組織学的、遺伝的およびマイクロ環境内腫瘍の不均一性を、表示します。小説を識別するために使用されるモデルの大部分は、治療は、これらの特徴の多くを組み込んでいないターゲット。確かに、診療所で利用電流標的療法は、二次元(2D)培養条件下で増殖させた癌細胞株に依存スクリーニングアプローチを採用し10年間で開発されてきました。このような受容体チロシンキナーゼ阻害剤として、様々な成功、もたらしたが、それは癌のより複雑なモデルが完全にin vivoで腫瘍形成を駆動してから移行する新しい治療法の数を増加させる要因を理解するために必要とされることが明らかになってきています臨床試験への前臨床モデル。また、現在ではよく2D培養システムがで反映しないことが理解されます行動1,2を生体内。例えば、不十分な血管新生化腫瘍では、微小環境内の酸素や栄養素の需要が供給を上回るように、ハイとローの配達の領域が開発しています。腫瘍における低酸素(低酸素症)の存在は、このような炭酸脱水酵素IX(CAIX)などの確立された低酸素マーカーのための腫瘍切片の免疫組織化学染色によって検出されるように、このようになどの機能を組み込んだ乳癌3,4で貧しい臨床転帰と相関しますスクリーニングモデルに低酸素症は、in vivoでより有効になる新規な薬物標的を発見するために私たちの能力を高めることができます。確かに、成功した低酸素症が含まれている攻撃的な腫瘍を標的とすることは、臨床的優先度5です。
従来の2DのsiRNAスクリーニングの改変は、より正確な腫瘍微小環境中の癌細胞が遭遇する条件の要素を再現する試みにおいて、いくつかの遺伝子番目の同定につながっていますインビボでの腫瘍増殖のために重要であることが見出されています。これらは、低血清条件6、低酸素状態7の下と組み合わせ8で行われ、機能ゲノムスクリーンを含みます。低血清中で増殖させた場合、例えば、6-Phosphofructo -2-キナーゼ/フルクトース-2,6-ビホスファターゼ4(PFKFB4)、炭素入る解糖の調節を担うタンパク質のサイレンシングは、唯一の転移に由来する前立腺癌細胞株においてアポトーシスを誘導しました。 PFKFB4の枯渇が完全に前立腺癌細胞株の異種移植片6の成長を切除、一方同じ条件下で、正常な前立腺細胞株におけるPFKFB4のサイレンシングは、効果がなかったです。
乳癌細胞株の延長パネルにおいて、モノカルボキシラーゼトランスポーター4(MCT4)のサイレンシングは、優先的に、低酸素条件下で細胞株の増殖の減少につながりました。この脆弱性は、乳癌細胞株直交異方性xenogra in vivoで検証しました。FTS。おそらく最も驚くべきことに、アセチル-CoAシンセターゼ2(ACSS2)、アセチル-CoAへの酢酸の変換に関与する酵素、栄養ストレス条件下で還元癌細胞数(低酸素および血清)のサイレンシングが、通常の培養条件の下でほとんどまたは全く効果がなかったです8。 ACSS2のアブレーションは、栄養勾配が腫瘍微小環境内で孤立して存在し、これらの地域に存在する細胞が腫瘍の進行8のために必須であることをしないことを示唆している乳癌および前立腺癌異種移植片の増殖に影響を与えました。また、ACSS2も腫瘍における増大ACSS2活性は不利な条件下での増殖をサポートする基本的なメカニズムであり得ることを示唆し、神経膠芽腫および肝細胞癌9,10において重要であることが見出されました。
集合的に、これらの研究は、 インビボで遭遇する条件を反復するとsiRNAのスクリーニングを行うことGの同定を可能にすることを証明します癌の生存に必須エン。同様に、栄養ストレス条件下で2D癌細胞の増殖に影響を与えるように、これらの研究における標的遺伝子の枯渇は、腫瘍異種移植片6,8で観察されたものをミラーリング、癌細胞株のスフェロイドの成長を阻害しました。したがって、癌細胞株のスフェロイドはACSS2サイレンシングに感受性を付与する腫瘍微小環境に遭遇する条件のいくつかを含有します。実際、スフェロイドは、栄養勾配(血清および酸素)、pHの変化、3次元(3D)細胞 – 細胞接触だけでなく、細胞周期停止およびアポトーシスを受けている細胞で増殖セレリティの変化を表示します。これは、壊死領域のがんスフェロイドにおける存在、従来の2D培養では見られない特徴が例示されます。
癌細胞のスフェロイドは既に小分子阻害剤をスクリーニングするために、より生物学的に関連するモデルとして使用されてきたが、これは唯一の化合物の有効性の検証やコンポの再利用を可能にしていますundsもともと他の疾患11のために設計します。現在の回転楕円体のスクリーニング方法は、高含量の方法のハイスループットで特定の遺伝子の枯渇の分析を可能にするものではありません。ここで、我々は、初めて癌細胞株のスフェロイドにおける低分子干渉RNA(siRNA)技術を利用し、特定の遺伝子の依存関係を解明するための機能ゲノミクスパイプラインを説明します。私たちは、人間の乳癌における200最も頻繁に変異遺伝子を標的とするsiRNAでオーダーメイドのライブラリを設計し、回転楕円体のサイズとBT474乳癌スフェロイドにおける代謝活性上の遺伝子の枯渇の影響を評価しました。我々は、堅牢かつ再現3D培養物ではサイレンシングERBB2およびPIK3CAの影響を検出することができました。さらに、我々は、免疫組織化学を使用して、BT474スフェロイドの空間的なアーキテクチャ上の遺伝子の枯渇の影響を評価することができます。
癌の三次元モデルは、ますます選択的に癌細胞を殺すために設計されている既知の及び新規な化合物の有効性を評価するために使用されています。癌細胞スフェロイドは、このように、3Dでの有効性を増加している化合物は、インビボでの効果を有する可能性がより高いインビボでの腫瘍において遭遇するものと類似の条件を表示する構造です。しかし、これらのモダリティは、癌を治療する際にかなりの効果を持つことができる薬物設計の対象とされていない潜在的な新規標的の同定を可能にするものではありません。
私たちは、癌細胞株スフェロイドで最大7日間耐久性の遺伝子サイレンシングのために許可されたsiRNA機能ゲノミクスのアプローチを開発しました。 siRNAスクリーニングを行うことができる前に、最適化を必要とするプロトコルには、いくつかの重要なステップがあります。大規模で再現可能な実行可能な球状体を形成する能力が不可欠です。また、ppropriateトランスフェクション条件を厳密に最適化されるべきです。我々は、適切な非標的といくつかの異なるトランスフェクション試薬を試用し、画面をしようとする前にコントロールを殺すことをお勧めします。我々は、いくつかの一般的に使用される乳癌細胞株、すなわちBT474、MCF10DCIS.com、MDA-MB-231及びJIMT1がsiRNAトランスフェクションに適したことを示すことができました。さらに、我々はBT474のスフェロイドにおける乳癌における200最も頻繁に変異遺伝子をスクリーニングする実証の原則データを提供する、HER2の増幅およびPIK3CAの発癌性変異に自分の依存関係を確認しました。興味深いことに、転写因子FOXO3のサイレンシングは、回転楕円体のサイズの縮小が、生存率に有意な影響をもたらしました。 FOXO3は、彼らの環境16をより容易に適応できるように、癌細胞の代謝能力を変化させる、低酸素状態に対する応答を調節することが知られています。それはATPの存在量を検出すると、この役割は、潜在的に細胞生存率の読み取りを妨げる可能性、細胞代謝の主な製品の一つ。
スフェロイド小型化の観察を支持し、HeLa細胞におけるFOXO3のサイレンシングは、腫瘍増殖を障害およびアポトーシス17を誘導した異種移植片が示されています。いくつかの遺伝子は、偽陽性をもたらす可能性がそれらの3D構造を、保持する癌細胞の能力に影響を与える可能性があることに留意することが重要です。例えば、E-カドヘリンのノックダウンは、BT474スフェロイド構造の溶解をもたらしました。これは、以前E-カドヘリンは、抗体18をターゲットに用いて報告されていました。任意のスクリーニングプラットフォームと同様に、潜在的なターゲットは、観察される効果の再現性を評価するために再スクリーニングされるべきです。技術、siRNA媒介遺伝子ノックダウンの、すなわち一時的な性質には制限があります。サイレンシング持続7日間より長くは、siRNAを用いて達成可能ではありませんでした。
このアプローチの利点は、様々な他の生物群系と結合することができるということですTRIC染料だけでなく、回転楕円体の低酸素症の空間的な情報を与えるか、アポトーシスを起こしている細胞を監視する、例えば、回転楕円体の生存率を評価するもの。プレートリーダーのスキャンは、比較的迅速かつ非侵襲性であるため、さらに、回転楕円体のサイズにsiRNAの影響は、時間の経過だけでなく、実験終了時点で評価することができます。確かに、我々は現在、我々のスクリーニングパイプライン内でこれらの道のいくつかを模索しています。新規の依存関係を識別するために、3D培養物を利用する別のアプローチは、標的またはタンパク質の特定のファミリーの広い範囲のいずれかを阻害する化学ライブラリーの使用です。実際、Bitler ら 。卵巣明細胞癌19でARID1A状態とEZH2阻害剤との間の合成致死相互作用を識別するために、このターゲットにアプローチを利用しました。 CRISPR-Cas9遺伝子編集技術の発見もオルガノイド培養およびin vivoでの遺伝子スクリーニングの開発を可能にしました。しかし、トン彼のアプローチは、適切な動物施設を有するに依存し、20法外な費用がかかることもできます。
結論として、我々は新たな癌標的または確立されたターゲットの強固な検証の識別を可能にすることが、より正確にモデル化酸素およびin vivoでの腫瘍の微小環境の特徴である栄養勾配、プロトコルを概説していると信じています。さらに、我々のプロトコルは、スフェロイドを形成し、従って日常ハイスループットsiRNAのスクリーニングのための癌研究コミュニティで使用することができる細胞系の任意のタイプに適用することができます。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
Celigo S | Nexcelom | contact company | |
Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
Benchtop centrifuge | Various | ||
Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
Mulitichannel pipette | Various |