Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
L'identificazione di eventi conducente funzionali nel cancro è fondamentale per promuovere la nostra comprensione della biologia del cancro e indispensabile per la scoperta della prossima generazione di nuovi bersagli farmacologici. Sta diventando evidente che i modelli più complessi di cancro sono necessari per apprezzare appieno i fattori che guidano tumorigenesi in vivo e aumentare l'efficacia di nuove terapie che rendono la transizione da modelli pre-clinici di sperimentazioni cliniche.
Qui vi presentiamo un metodo per la generazione di sferoidi tumorali uniformi e riproducibili che possono essere sottoposti a controlli siRNA funzionale. Questi sferoidi mostrano molte caratteristiche che si trovano nei tumori solidi che non sono presenti nella cultura tradizionale a due dimensioni. Abbiamo dimostrato che diverse linee di cellule di cancro al seno comunemente usati sono suscettibili di questo protocollo. Inoltre, mettiamo a disposizione una prova di principio i dati utilizzando la linea di cellule di cancro al seno BT474, confermando la lorodipendenza amplificazione del fattore di crescita epidermico recettore HER2 e mutazione del fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato 3-chinasi (PIK3CA) quando coltivata come sferoidi tumorali. Infine, siamo in grado di approfondire e confermare l'impatto spaziale di queste dipendenze utilizzando immunoistochimica.
Tumori solidi mostrano significativi istologici, l'eterogeneità intra-tumorale genetica e micro-ambientale, che presenta i medici con una sfida significativa nel riuscire a curare i pazienti con successo. La maggior parte dei modelli utilizzati per identificare romanzo terapie mirate non incorporano molte di queste caratteristiche. Infatti, gli attuali terapie mirate utilizzati in clinica sono stati sviluppati negli ultimi dieci anni impiegando approcci di screening che si basano su linee cellulari tumorali coltivate in condizioni (2D) cultura bidimensionali. Anche se questo ha portato a vari successi, come gli inibitori del recettore tirosin-chinasi, sta diventando evidente che i modelli più complessi di cancro sono necessari per apprezzare appieno i fattori che guidano tumorigenesi in vivo e aumentare il numero di nuove terapie che rendono il passaggio dalla modelli pre-clinici alla sperimentazione clinica. Inoltre, è ormai ben apprezzato il fatto che sistemi di coltura 2D non riflettono videodanVIVO comportamento 1,2. Ad esempio, nei tumori vascolarizzati scarsamente, come la domanda di ossigeno e nutrienti nel microambiente superare l'offerta, regioni di consegne alte e basse sviluppano. La presenza di bassi livelli di ossigeno (ipossia) nei tumori, come rilevato dalla colorazione immunoistochimica di sezioni tumorali per i marcatori di ipossia affermati come anidrasi carbonica IX (CAIX), correla con un esito clinico peggiore nel cancro al seno 3,4 caratteristiche Così che incorporano come ipossia in modelli di screening può migliorare la nostra capacità di scoprire nuovi bersagli farmacologici che sarà più efficace in vivo. Infatti, rivolti con successo tumori aggressivi che contengono l'ipossia è una priorità clinica 5.
L'alterazione dello screening tradizionale 2D siRNA, nel tentativo di ricapitolare più accuratamente elementi delle condizioni incontrate dalle cellule tumorali nel microambiente tumorale, ha portato all'identificazione di diversi geni tha sono stati trovati per essere importante per la crescita del tumore in vivo. Questi includono schermi di genomica funzionale eseguite in condizioni di siero basse 6, condizioni di ipossia 7 e 8 in combinazione. Ad esempio, il silenziamento di 6-Phosphofructo-2-Kinase / Fruttosio-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), una proteina responsabile della regolazione carbonio che entra glicolisi, indotto solo apoptosi nelle linee di cancro alla prostata derivate da metastasi quando coltivate in basso siero. Silenziamento di PFKFB4 nelle normali linee di cellule della prostata, alle stesse condizioni ha avuto alcun effetto, mentre, l'esaurimento delle PFKFB4 completamente ablated la crescita della linea di cellule di cancro alla prostata xenotrapianti 6.
In un pannello esteso di linee cellulari di cancro al seno, il silenziamento di mono-carbossilasi trasportatore 4 (MCT4) preferenzialmente portato alla riduzione della crescita linea cellulare in condizioni di bassa ossigeno. Questa vulnerabilità è stato convalidato in vivo nel cancro al seno linea cellulare ortotropa xenograFTS. Forse la cosa più sorprendente, mettendo a tacere di acetil-CoA sintetasi 2 (ACSS2), un enzima responsabile della conversione di acetato in acetil-CoA, ridotto numero di carcinoma a cellule in condizioni di stress di nutrienti (basso tenore di ossigeno e siero), ma ha avuto poco o nessun effetto in condizioni di coltura normali 8. Ablazione del ACSS2 influenzato la crescita del seno e alla prostata xenotrapianti che suggeriscono che i gradienti di nutrienti non esistono in isolamento all'interno del microambiente tumorale e che le cellule che si trovano in queste regioni sono essenziali per la progressione del tumore 8. Inoltre, ACSS2 è stato anche trovato per essere importante nel glioblastoma e carcinomi epatocellulari 9,10, suggerendo che l'aumento dell'attività ACSS2 nei tumori potrebbe essere un meccanismo fondamentale che sostiene la crescita in condizioni sfavorevoli.
Collettivamente, questi studi dimostrano che riassuntiva delle condizioni incontrate in vivo ed eseguendo schermi siRNA consente l'identificazione di gEnes essenziali per la sopravvivenza del cancro. Così come impattare la crescita delle cellule del cancro 2D in condizioni di stress dei nutrienti, l'esaurimento di geni bersaglio in questi studi ha inibito il cancro linea di cellule crescita sferoide, rispecchiando quello che è stato osservato in xenotrapianti tumorali 6,8. Così, sferoidi linee cellulari di cancro contengono molte delle condizioni incontrate nel microambiente tumorale che conferiscono la sensibilità al ACSS2 silenziamento. Infatti, sferoidi visualizzare le sfumature di nutrienti (siero e ossigeno), variazioni di pH, tridimensionale (3D) il contatto cellula-cellula, ma anche, alterazioni nella celerità proliferativa con cellule in fase di arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi. Questo è esemplificato dalla presenza nel sferoidi tumorali di regioni necrotiche, una caratteristica non trovata in coltura tradizionale 2D.
sferoidi di cellule di cancro sono già stati utilizzati come modelli più biologicamente rilevanti per lo screening di piccole molecole inibitrici, ma questo consente solo per la validazione di efficacia composto o il riutilizzo dei compounds originariamente progettare per altre malattie 11. Attuali metodi di screening sferoide non consentono l'analisi di esaurimento gene specifico in un alto rendimento di modo alta contenuti. Qui, descriviamo per la prima volta, una conduttura genomica funzionale per scoprire le dipendenze di geni specifici che utilizzano la tecnologia small interfering RNA (siRNA) in sferoidi linee cellulari tumorali. Abbiamo progettato una libreria su misura con siRNA di targeting dei 200 geni più frequentemente mutato nei tumori mammari umani e valutato l'impatto di esaurimento gene sul formato sferoide e l'attività metabolica in BT474 sferoidi di cancro al seno. Siamo stati in grado di robusto e riproducibile di rilevare l'impatto della ERBB2 e PIK3CA tacere nelle culture 3D. Inoltre, si potrebbe valutare l'impatto di esaurimento gene sull'architettura spaziale di sferoidi BT474 con immunoistochimica.
modelli tridimensionali di cancro sono sempre più utilizzati per valutare l'efficacia di composti noti e nuovi che sono stati progettati per uccidere selettivamente le cellule tumorali. Sferoidi di cellule di cancro sono strutture che presentano condizioni più simili a quelle incontrate nei tumori in vivo, così composti che hanno aumentato l'efficacia in 3D sono più probabilità di avere un effetto in vivo. Tuttavia, queste modalità non consentono l'identificazione di potenziali nuovi bersagli che non sono stati oggetto di disegno farmaco che potrebbe avere una notevole efficacia nel trattamento del cancro.
Abbiamo sviluppato un approccio di genomica funzionale siRNA che ha permesso di lunga durata silenziamento genico fino a sette giorni di sferoidi linee cellulari tumorali. Ci sono diversi passaggi critici al protocollo che richiedono l'ottimizzazione prima di uno schermo siRNA può essere eseguita. La capacità di formare sferoidi vitali riproducibili su larga scala è essenziale. Inoltre, uncondizioni di trasfezione ppropriate devono essere rigorosamente ottimizzate. Vi proponiamo di trialing diversi reagenti di trasfezione differenti con adeguate non-targeting e uccidendo i controlli prima di tentare lo schermo. Siamo stati in grado di dimostrare che le diverse linee di cellule di cancro al seno di uso comune, vale a dire BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 e JIMT1 erano suscettibili di siRNA trasfezione. Inoltre, mettiamo a disposizione una prova di principio i dati di screening dei 200 geni più frequentemente mutato nel cancro al seno in sferoidi BT474, confermato la loro dipendenza da amplificazione del HER2 e la mutazione oncogenica di PIK3CA. È interessante notare, silenziamento del fattore di trascrizione foxo3 comportato una riduzione delle dimensioni sferoide ma nessun effetto significativo sulla vitalità. Foxo3 è noto regolare la risposta all'ipossia, alterando la capacità metabolica delle cellule tumorali permettendo loro di adattarsi più facilmente al loro ambiente 16. Questo ruolo potrebbe potenzialmente interferire con la lettura vitalità cellulare in quanto rileva ATP abbondanza, Uno dei principali prodotti del metabolismo cellulare.
A sostegno di osservazione di una riduzione delle dimensioni sferoide, è stato dimostrato che il silenziamento di foxo3 in HeLa eterotrapianti compromessa la crescita tumorale e l'apoptosi indotta 17. E 'importante notare che alcuni geni possono influenzare la capacità delle cellule tumorali di mantenere la loro architettura 3D, che potrebbe causare falsi positivi. Per esempio, l'abbattimento di E-caderina ha provocato la dissoluzione della struttura BT474 sferoide. Questo era stato precedentemente segnalato tramite E-caderina anticorpi 18 di mira. Come con qualsiasi piattaforma di screening, i potenziali obiettivi dovrebbero essere nuovo controllo per valutare la riproducibilità dell'effetto osservato. Esistono limitazioni alla tecnica, cioè la natura transitoria del silenziamento genico siRNA-mediata. Sostenuta tacere più di sette giorni non era realizzabile con siRNA.
Il vantaggio di questo approccio è che può essere accoppiato con vari altri biomecoloranti Tric non solo quelli che valutano sferoide viabilità, per esempio, dare informazioni spaziali di ipossia sferoide o monitorare le cellule in fase di apoptosi. Inoltre, poiché le scansioni Plate Reader sono relativamente rapido e non invasivo, l'impatto di siRNAs sulle dimensioni sferoide può essere valutata nel tempo piuttosto che nel punto finale sperimentale. In effetti, stiamo attualmente esplorando alcuni di questi viali all'interno della nostra pipeline di screening. Un approccio alternativo che utilizza colture 3D per identificare nuovi dipendenze è l'uso di librerie chimiche che inibiscono sia un'ampia gamma di obiettivi o determinate famiglie di proteine. Infatti, Bitler et al. utilizzato questo approccio mirato per identificare l'interazione letalità sintetica tra lo stato e gli inibitori ARID1A EZH2 in ovarico carcinomi a cellule chiare 19. La scoperta della tecnologia di editing gene CRISPR-Cas9 ha anche permesso lo sviluppo di schermi genetiche in culture organoide e in vivo. Tuttavia, til suo approccio è dipendente dotato di adeguate strutture per animali e possono essere costi proibitivi 20.
In conclusione, riteniamo che abbiamo delineato un protocollo che più precisamente i modelli ossigeno e nutrienti sfumature, che sono caratteristiche del microambiente tumorale in vivo, per consentirne l'identificazione di bersagli tumorali nuovi prodotti o la convalida robusta degli obiettivi stabiliti. Inoltre, il protocollo può essere applicato a qualsiasi tipo di linea di cellule che forma sferoidi e quindi può essere utilizzato di routine nella comunità di ricerca cancro per schermi siRNA alto rendimento.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
Celigo S | Nexcelom | contact company | |
Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
Benchtop centrifuge | Various | ||
Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
Mulitichannel pipette | Various |