Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
זיהוי של אירועי נהג תפקודיים בסרטן הוא מרכזי בקידום ההבנה שלנו של ביולוגית הסרטן והכרחי על הגילוי של הדור הבא של מטרות תרופה חדשניות. זה נהיה ברור כי מודלים מורכבים יותר של סרטן נדרשים להעריך במלואה את הגורמים התורמים שמניעים tumorigenesis in vivo ולהגדיל את היעילות של טיפולים חדשניים שהופכים את המעבר ממודלים טרום קליניים ניסויים קליניים.
כאן אנו מציגים מתודולוגיה להפקה spheroids גידול אחיד לשחזור שניתן נתון ההקרנה פונקציונלית siRNA. spheroids אלה מפגינים מאפיינים רבים הנמצאים בגידולים מוצקים שאינם נוכחים בתרבות דו מימד המסורתית. אנו מראים כי שורות תאים כמה נפוץ סרטן השד ניתן בפרוטוקול זה. יתר על כן, אנו מספקים הוכחה של עיקרון נתוני ניצול BT474 שורת תאי סרטן השד, מאשר שלהםהתלות הגברה של הקולטן לגורם הצמיחה אפידרמיס HER2 ו מוטציה של phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) כאשר גדל כמו spheroids הגידול. לבסוף, אנו מסוגלים לבדוק את העניין לעומק ולאשר את ההשפעה המרחבית של תלות אלה באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
גידולים מוצקים להציג היסטולוגית משמעותית, גנטי מייקרו-סביבתי ההטרוגניות תוך-גידול, המציג קלינאים עם אתגר משמעותי יכולת לטפל בחולים בהצלחה. רוב המודלים המשמשים לזהות רומן ממוקד טיפולים לא לשלב רב של תכונות אלה. אכן, טיפולים ממוקדים נוכחיים מנוצלים במרפאת פותחו בעשור האחרון העסיקו גישות הקרנה המסתמכות על שורות תאי הסרטן גדלות תחת דו ממדים (2D) תנאי תרבות. אמנם זה הביא הצלחות שונות, כגון מעכבי טירוזין קינאז קולטן, מתחוור כי מודלים מורכבים יותר של סרטן נדרשים להעריך במלואה את הגורמים התורמים שמניעים tumorigenesis in vivo ו להגדיל את מספר טיפולים חדשים שהופכים את המעבר מודלים פרה-קליניים ניסויים קליניים. יתר על כן, הוא מעריך כעת גם כי מערכות תרבות 2D מצליחות לשקףvivo התנהגות 1,2. לדוגמא, בגידולי vascularized גרועים, שכן ביקוש חמצן וחומרים מזינים במייקרו-הסביבה להצליח לספק, אזורים של משלוחים גבוהים ונמוכים לפתח. בנוכחות חמצן נמוך (היפוקסיה) אל תוך גידולים, כפי שזוהה על ידי מכתים immunohistochemical סעיפי גידול סמנים היפוקסי ותיקים כגון anhydrase פחמתית IX (קיי), עולה בקנה אחד עם תוצאות קליניות עניות בסרטן השד 3,4 תכונות שילוב לפיכך כגון היפוקסיה לתוך מודלי הקרנה עשויה לשפר את היכולת שלנו לגלות מטרות תרופה חדשניות כי תהיינה יעיל יותר in vivo. ואכן, בהצלחה מיקוד גידולים אגרסיביים המכילים היפוקסיה היא בעדיפות קלינית 5.
שינוי של ההקרנה המסורתית 2D siRNA, בניסיון ליתר דיוק לשחזר אלמנטים של התנאים בהם נתקלים תאים סרטניים במיקרו-סביבה של הגידול, הוביל לזיהוי של מספר גנים הבבית כבר נמצא כחשוב לצמיחת גידול in vivo. אלה כוללים מסכי גנומית תפקודיים להתבצע בתנאים בסרום נמוכים 6, תנאי חוסר חמצן 7 ו בשילוב 8. לדוגמה, השתקת 6-Phosphofructo-2-קינאז / פרוקטוז-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), חלבון האחראי על ויסות הגליקוליזה הזנת פחמן, רק לאפופטוזיס בקווים סרטן הערמונית נגזר גרורות כאשר גדל בסרום נמוך. השתקת PFKFB4 בשורות תאי ערמונית נורמליות באותם תנאים לא הייתה השפעה, ואילו, דלדול של PFKFB4 לחלוטין ablated הצמיחה של שורת תאי סרטן ערמונית xenografts 6.
בהרכב מורחב של שורות תאי סרטן השד, השתקת טרנספורטר מונה-carboxylase 4 (MCT4) הובילה מועדף להפחתת צמיחת שורת תאים בתנאים של רמות חמצן נמוכים. פגיעות זו קיבלה תוקף in vivo ב xenogra orthotropic קו תאי סרטן השדFTS. אולי הכי בולט, השתקה של synthetase Acetyl-CoA 2 (ACSS2), אנזים האחראי על ההפיכה תצטט לתוך אצטיל-CoA, מספר תאי סרטן מופחת בתנאי קיצון מזין (חמצן נמוך בדם) אבל היה מעט או ללא השפעה בתנאי תרבות הנורמליות 8. אבלציה של ACSS2 השפיעו על הצמיחה של xenografts סרטן השד והערמונית דבר המצביע על כך שהפרשי מזין אינם קיימים בבידוד במיקרו-סביבה של הגידול וכי תאים הנמצאים באזורים אלו חיוניים התקדמות הגידול 8. יתר על כן, ACSS2 נמצאה גם להיות חשוב גליובלסטומה קרצינומה hepatocellular 9,10, דבר המצביע על כך פעילות ACSS2 מוגברת בגידולים יכול להיות מנגנון יסודי התומכת בצמיחה בתנאים נחותים.
ככלל, מחקרים אלה מוכיחים כי משחזרת התנאים נתקלו in vivo וביצוע מסכי siRNA מאפשרת זיהוי של gEnes חיונית להישרדות סרטן. כמו גם להשפיע על גדילת תאים סרטניים 2D בתנאי קיצון מזין, דלדול של גני מטרה במחקרים אלה מעכבות צמיחה אליפטית קו תאים סרטניים, שיקוף מה נצפתה xenografts הגידול 6,8. לפיכך, spheroids קו תאים סרטניים מכילים כמה מן התנאים נתקל במיקרו-סביבה של הגידול המקנים רגישות השתקה ACSS2. ואכן, spheroids להציג הדרגתיים מזינים (סרום וחמצן), שינויים ב- pH, תלת ממדי (3D) קשר בין תאים, אלא גם, שינויי חישת שגשוג עם תאים שעברו עיכוב מחזור תא אפופטוזיס. זה בא לידי ביטוי על ידי נוכחות spheroids סרטן של אזורים נמקי, תכונה לא נמצא בתרבות 2D המסורתית.
spheroids תאים סרטניים כבר שימשו מודלים רלוונטיים יותר ביולוגית להקרין מעכבי מולקולה קטנה אבל זה מאפשר רק עבור אימות של יעילות מתחם או repurposing של רכיבי מדיהunds במקור לעצב עבור מחלות אחרות 11. שיטות הקרנה אליפטית נוכחיות אינן מאפשרות הניתוח של דלדול גן ספציפי בתוך תפוקה גבוהה של אופן גבוה תוכן. כאן אנו מתארים בפעם הראשונה, צינור גנומיקה תפקודית לחשיפת תלות גן ספציפי ניצול RNA התערבות קטנה (siRNA) הטכנולוגיה spheroids קו תאים סרטניים. עצבנו ספרייה העידה עם siRNAs מיקוד 200 הגנים שעברו מוטציה בתדירות הגבוהה ביותר של סרטן השד אנושי הערכתי את ההשפעה של דלדול גן על גודל אליפטית ופעילות מטבולית spheroids סרטן שד BT474. הצלחנו וחסונה ו reproducibly לזהות את ההשפעה של ERBB2 ו PIK3CA השתקה בתרבויות 3D. יתר על כן, אנחנו יכולים להעריך את ההשפעה של דלדול הגן על ארכיטקטורת מרחבית של spheroids BT474 באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
תלת ממד דגמים של הסרטן שמתבצעים מועסקים ויותר להעריך את היעילות של תרכובות ידועות רומן אשר עוצבו להרוג באופן סלקטיבי תאי סרטן. Spheroids תאים סרטניים הם מבנים המציגים תנאים נוספים הדומים לאלה נתקל בגידולים in vivo, ובכך תרכובות גדלו יעילות 3D נוטים יותר להיות השפעה in vivo. עם זאת, שיטות אלו אינן מאפשרות זיהוי של מטרות רומן פוטנציאל שלא היו הנושא תכנון תרופות, שיכולה להיות להם יעילות רבה בטיפול בסרטן.
פיתחנו גישה גנומיקה תפקודית siRNA שאיפשרו להשתקת גנים עמיד למשך עד שבעה ימים spheroids קו תאים סרטניים. ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול הדורשים ייעול לפני מסך siRNA יכול להתבצע. היכולת ליצור spheroids קיימא לשחזור בקנה מידה גדול היא חיונית. יתר על כן,תנאי transfection ppropriate צריכים להיות מותאמים בקפידה. אנו ממליצים trialing מספר ריאגנטים transfection שונים עם זכויות שאינן מקנות מיקוד המתאים והרג שולטת לפני שתנסה המסך. הצלחנו להראות כי שורות תאים סרטניים כמה נפוץ השד, כלומר BT474, MCF10DCIS.com, מד"א- MB-231 ו JIMT1 היו מקובל transfection siRNA. יתר על כן, אנו מספקים הוכחה של עיקרון נתונים ההקרנה 200 ביותר גנים שעברו מוטציה לעתים קרובות סרטן השד spheroids BT474, אישר את תלותם הגברה של HER2 מוטציה בשעור של PIK3CA. מעניין, השתקה של FOXO3 גורם שעתוק הביא לירידה בגודל אליפטית אך ללא השפעה משמעותית על כדאיות. FOXO3 ידוע להסדיר את התגובה היפוקסיה, לשנות את קיבולת המטבולית של תאי סרטן ומאפשר להם להסתגל ביתר קלות לסביבתם 16. תפקיד זה באופן פוטנציאלי יכול מפריעים לקריאת כדאיות התא כפי שהוא מזהה שפע ATP, אחד המוצרים העיקריים של חילוף חומרים בתא.
בתמיכה של התצפית של צמצום גודל אליפטית, הוכיח כי השתקת FOXO3 ב הלה xenografts לקוי צמיחת גידול לאפופטוזיס 17. חשוב לציין כי חלק גנים עשויים להשפיע לרעה על יכולתו של תאים סרטניים שומרת על ארכיטקטורת 3D שלהם, אשר עלול לגרום חיוביות שגויות. לדוגמא, מציאה של E-cadherin הביאה לפירוק המבנה אליפטית BT474. זה בעבר דיווח באמצעות E-cadherin ממוקד נוגדנים 18. כמו עם כל פלטפורמת הקרנה, מטרות פוטנציאליות, יש rescreened להעריך את השחזור של האפקט שנצפה. ישנן מגבלות על הטכניקה, כלומר האופי הזמני של מציאת הגן בתיווך siRNA. מתמשכת השתקה יותר משבעה ימים לא היה בר השגה עם siRNA.
היתרון של גישה זו הוא כי זה יכול להיות בשילוב עם סביבה אקולוגית שונה אחרתצבעי tric ולא רק במקומות להעריך כדאיות אליפטית, למשל, מתן מידע מרחבים של היפוקסיה אליפטית או ניטור תאים העוברים אפופטוזיס. יותר מכך, כיוון הסריקות קוראות צלחת יחסי מהירות ולא פולשנית, ההשפעה של siRNAs על גודל אליפטית ניתן להעריך לאורך זמן ולא רק בנקודת הסיום הניסיונית. ואכן, אנו בוחנים בימים אלה כמה אפיקים אלה נמצאים בצנרת ההקרנה שלנו. גישה חלופית אשר מנצלת תרבויות 3D לזהות תלות רומן היא השימוש בספריות כימיות המעכבות או מגוון רחב של מטרות או משפחות מסוימות של חלבונים. ואכן, Bitler et al. מנוצל גישה ממוקדת זו כדי לזהות את האינטראקציה הקטלנית הסינטתית בין מעמד ARID1A ומעכבי EZH2 ב קרצינומה תאים הברורה השחלות 19. התגלית של עריכת טכנולוגיה גנים CRISPR-Cas9 אפשרה גם לפיתוח מסכי גנטי בתרבויות organoid in vivo. עם זאת, לאגישתו תלויה שיש מתקני חיה מתאימים וניתן לעלות 20 מונע.
לסיכום, אנו מאמינים כי גבשנו פרוטוקול בצורה מדויקת יותר מודלים הדרגתי חמצן וחומרי הזנה, שהן תכונות של microenvironment גידול in vivo, המאפשרות זיהוי של מטרות סרטן רומן או אימות חזקות של יעדים שנקבעו. יתר על כן, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם על כל סוג של שורת התאים המהווה spheroids ומכאן ניתן להשתמש באופן שגרתי דעה בקהילת חקר הסרטן למסכי siRNA תפוקה גבוהה.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
Celigo S | Nexcelom | contact company | |
Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
Benchtop centrifuge | Various | ||
Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
Mulitichannel pipette | Various |