Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
L'identification des événements de pilotes fonctionnels dans le cancer est au cœur de favoriser notre compréhension de la biologie du cancer et indispensable pour la découverte de la prochaine génération de nouvelles cibles thérapeutiques. Il devient évident que les modèles plus complexes de cancer sont nécessaires pour apprécier pleinement les facteurs qui stimulent la tumorigenèse in vivo et d' augmenter l'efficacité de nouvelles thérapies qui font la transition à partir de modèles pré-cliniques pour les essais cliniques.
Nous présentons ici une méthode pour générer des sphéroïdes tumoraux uniformes et reproductibles qui peuvent être soumis à un criblage fonctionnel siRNA. Ces sphéroïdes présentent de nombreuses caractéristiques que l'on trouve dans les tumeurs solides qui ne sont pas présentes dans la culture à deux dimensions traditionnelles. Nous montrons que plusieurs lignées de cellules de cancer du sein couramment utilisées se prêtent à ce protocole. En outre, nous fournissons la preuve de principe des données utilisant le cancer du sein lignée cellulaire BT474, confirmant leurdépendant de l'amplification du récepteur du facteur de croissance épidermique HER2 et la mutation de la phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) lorsqu'elles sont cultivées sous forme de sphéroïdes de tumeur. Enfin, nous sommes en mesure d'étudier plus avant et de confirmer l'impact spatial de ces dépendances en utilisant immunohistochimie.
Les tumeurs solides affichent histologique significative, l'hétérogénéité intra-tumorale génétique et micro-environnement, qui présente aux cliniciens un défi important d'être en mesure de traiter les patients avec succès. La majorité des modèles utilisés pour identifier de nouvelles thérapies ciblées ne comportent pas beaucoup de ces caractéristiques. En effet, les thérapies ciblées actuelles utilisées en clinique ont été développés dans la dernière décennie, en utilisant des approches de criblage qui reposent sur des lignées de cellules cancéreuses cultivées dans des conditions bidimensionnelles (2D) de la culture. Bien que cela ait provoqué des succès divers, tels que les inhibiteurs du récepteur tyrosine kinase, il devient évident que les modèles plus complexes de cancer sont nécessaires pour apprécier pleinement les facteurs qui stimulent la tumorigenèse in vivo et d' augmenter le nombre de nouvelles thérapies qui font la transition de modèles précliniques aux essais cliniques. De plus, il est maintenant bien apprécié que les systèmes de culture 2D ne reflètent trvivo comportement 1,2. Par exemple, dans les tumeurs vascularisées mal, car la demande d'oxygène et de nutriments dans le microenvironnement supérieure à l'offre, les régions de livraisons hautes et basses se développent. La présence de faible teneur en oxygène (hypoxie) dans les tumeurs, telles que détectées par la coloration immunohistochimique de coupes de tumeur pour les marqueurs de hypoxiques établis tels que l' anhydrase carbonique IX (CAIX), est en corrélation avec un résultat clinique plus faible dans le cancer du sein 3,4 Ainsi , les caractéristiques incorporant tel que hypoxie dans les modèles de dépistage peut améliorer notre capacité à découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques qui seront plus efficaces in vivo. En effet, ciblant avec succès des tumeurs agressives qui contiennent l' hypoxie est une priorité clinique 5.
La modification de criblage traditionnelle 2D ARNsi, dans une tentative pour récapituler avec plus de précision les éléments des conditions rencontrées par les cellules cancéreuses dans le microenvironnement tumoral, a conduit à l'identification de plusieurs gènes eà se sont révélés être importants pour la croissance tumorale in vivo. Ceux – ci comprennent des écrans de génomique fonctionnelle effectuées dans des conditions de sérum bas 6, des conditions hypoxiques 7 et 8 en combinaison. Par exemple, le silençage de 6-phosphofructo-2-kinase / fructose-2,6-biphosphatase 4 (PFKFB4), une protéine responsable de la régulation du carbone glycolyse entrant, seul induit l'apoptose dans les lignées de cancer de la prostate dérivées de métastases lorsqu'il est cultivé dans un faible taux sérique. Silencing de PFKFB4 dans des lignées cellulaires de la prostate normales dans les mêmes conditions n'a eu aucun effet, alors que, l' épuisement des PFKFB4 complètement ablatée la croissance de la prostate lignée cellulaire de cancer xénogreffes 6.
Dans un panneau d'extension de lignées cellulaires de cancer du sein, le silençage de mono-carboxylase transporteur 4 (MCT4), de préférence conduit à la réduction de la croissance de la lignée cellulaire dans des conditions de faible teneur en oxygène. Cette vulnérabilité a été validée in vivo dans le cancer du sein lignée cellulaire orthotrope xenografts. Peut-être le plus frappant, réduisant au silence de l'acétyl-CoA synthétase 2 (ACSS2), une enzyme responsable de la conversion de l'acétate en acétyl-CoA, réduit le cancer nombre de cellules dans des conditions de stress en nutriments (faible teneur en oxygène et le sérum), mais a eu peu ou pas d'effet dans des conditions normales de culture 8. Ablation de ACSS2 impacté la croissance du cancer du sein et de la prostate xénogreffes suggérant que les gradients de nutriments ne sont pas isolés dans le microenvironnement de la tumeur et que les cellules qui se trouvent dans ces régions sont essentielles à la progression tumorale 8. En outre, ACSS2 a également été jugée importante dans le glioblastome et le carcinome hépatocellulaire 9,10, ce qui suggère que l' augmentation de l' activité de ACSS2 dans des tumeurs pourrait être un mécanisme essentiel qui soutient la croissance , dans des conditions défavorables.
Collectivement, ces études démontrent que récapitulant les conditions rencontrées in vivo et la réalisation d' écrans d'ARNsi permet l'identification de gènes essentiels pour la survie du cancer. Ainsi que d'un impact sur la croissance des cellules cancéreuses en 2D dans des conditions de stress en nutriments, l' épuisement des gènes cibles dans ces études ont inhibé la croissance de la sphéroïde lignée cellulaire de cancer, ce qui reflète ce qui a été observé dans des xénogreffes de tumeur à 6,8. Ainsi, les sphéroïdes de lignées cellulaires cancéreuses contiennent plusieurs des conditions rencontrées dans le microenvironnement tumoral qui confèrent une sensibilité à ACSS2 silençage. En effet, les sphéroïdes présentent des gradients de nutriments et d'oxygène (sérum), des variations de pH, en trois dimensions (3D) de contact cellule-cellule, mais aussi, des altérations dans la célérité proliférative des cellules subissant une apoptose et un arrêt du cycle cellulaire. Ceci est illustré par la présence d'un cancer dans sphéroïdes des régions nécrotiques, une caractéristique non trouvée dans la culture traditionnelle 2D.
sphéroïdes de cellules cancéreuses ont déjà été utilisés comme modèles biologiquement plus pertinents pour cribler des inhibiteurs de petites molécules, mais cela ne permet la validation de l'efficacité du composé ou du reciblage des compounds conception à l' origine pour d' autres maladies 11. méthodes de dépistage sphéroïde actuelles ne permettent pas pour l'analyse de l'épuisement du gène spécifique dans un haut débit de manière à haute teneur. Ici, nous décrivons pour la première fois, un pipeline de génomique fonctionnelle pour découvrir les dépendances de gènes spécifiques en utilisant des petits ARN interférents (siRNA) la technologie dans le cancer sphéroïdes de lignées cellulaires. Nous avons conçu une bibliothèque sur mesure avec siRNA ciblant les 200 gènes les plus fréquemment mutés dans les cancers du sein humains et évalué l'impact de l'épuisement du gène de la taille sphéroïde et l'activité métabolique dans BT474 sphéroïdes de cancer du sein. Nous avons pu détecter robuste et reproductible l'impact de ERBB2 et PIK3CA taire dans les cultures 3D. De plus, nous avons pu évaluer l'impact de l'épuisement des gènes sur l'architecture spatiale de sphéroïdes BT474 utilisant immunohistochimie.
des modèles tridimensionnels de cancer sont de plus en plus utilisées pour évaluer l'efficacité des composés connus et nouveaux qui ont été conçus pour tuer sélectivement des cellules cancéreuses. Sphéroïdes de cellules cancéreuses sont des structures qui présentent des conditions similaires à celles rencontrées dans les tumeurs in vivo, donc des composés ayant une efficacité accrue en 3D sont plus susceptibles d'avoir un effet in vivo. Cependant, ces modalités ne permettent pas l'identification de nouvelles cibles potentiellement qui n'a pas fait l'objet de la conception de médicaments qui pourraient avoir une efficacité considérable dans le traitement du cancer.
Nous avons développé un siRNA génomique fonctionnelle approche qui a permis l'inactivation de gène durable pour un maximum de sept jours dans le cancer sphéroïdes lignée cellulaire. Il y a plusieurs étapes critiques du protocole qui nécessitent une optimisation devant un écran de siRNA peut être effectuée. L'aptitude à former des sphéroïdes viables et reproductibles à grande échelle est essentielle. Par ailleurs, unconditions de transfection ppropriate doivent être rigoureusement optimisés. Nous suggérons trialing plusieurs réactifs de transfection différentes avec des non-ciblage approprié et des contrôles tuer avant d'essayer l'écran. Nous avons pu montrer que plusieurs lignées de cellules de cancer du sein couramment utilisés, à savoir BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 et JIMT1 étaient prête à siRNA transfection. En outre, nous fournissons la preuve de principe des données de dépistage des 200 gènes les plus fréquemment mutés dans le cancer du sein chez les sphéroïdes BT474, ont confirmé leur dépendance sur l'amplification de HER2 et la mutation oncogénique de PIK3CA. Fait intéressant, le silençage du FOXO3 facteur de transcription a entraîné une réduction de la taille sphéroïde, mais aucun effet significatif sur la viabilité. FOXO3 est connu pour réguler la réponse à l' hypoxie, ce qui modifie la capacité métabolique des cellules cancéreuses qui leur permet d'adapter plus facilement à leur environnement 16. Ce rôle pourrait interférer avec la lecture de la viabilité des cellules qu'il détecte ATP abondance, L'un des principaux produits du métabolisme cellulaire.
À l' appui de l'observation d'une réduction de la taille sphéroïde, il a été démontré que le silençage de FOXO3 HeLa dans des xénogreffes de tumeur altération de la croissance et de l' apoptose 17 induite. Il est important de noter que certains gènes peuvent influer sur la capacité des cellules cancéreuses à conserver leur architecture 3D, ce qui pourrait entraîner des résultats faussement positifs. Par exemple, knockdown de E-cadhérine a abouti à la dissolution de la structure sphéroïde BT474. Cela avait déjà été signalé en utilisant E-cadhérine anticorps 18 ciblé. Comme avec toute plateforme de criblage, des cibles potentielles devraient être de nouveau criblées pour évaluer la reproductibilité de l'effet observé. Il y a des limites à la technique, à savoir la nature transitoire du gène knockdown de siRNA à médiation. Soutenus au silence plus de sept jours n'a pas été possible avec le siRNA.
L'avantage de cette approche est qu'elle peut être couplée avec divers autres biomecolorants triques non pas seulement ceux qui évaluent la viabilité sphéroïde, par exemple, en donnant l'information spatiale de l'hypoxie sphéroïde ou des cellules de surveillance subissant une apoptose. En outre, parce que les scans de lecteur de plaque sont relativement rapide et non invasive, l'impact de siRNA sur la taille sphéroïde peut être évaluée au fil du temps plutôt que juste au point final expérimental. En effet, nous étudions actuellement plusieurs de ces avenues au sein de notre pipeline de dépistage. Une approche alternative qui utilise des cultures 3D pour identifier de nouvelles dépendances est l'utilisation des bibliothèques chimiques qui inhibent large, soit une gamme de cibles ou de familles particulières de protéines. En effet, Bitler et al. utilisé cette approche ciblée pour identifier l'interaction de létalité synthétique entre le statut de ARID1A et les inhibiteurs EZH2 dans l' ovaire carcinomes à cellules claires 19. La découverte de CRISPR-cas9 technologie d'édition de gènes a également permis le développement d'écrans génétiques dans les cultures organoïdes et in vivo. Cependant, le tson approche dépend de disposer d' installations appropriées sur l'animal et peut être un coût prohibitif 20.
En conclusion, nous croyons que nous avons décrit un protocole que les modèles plus précisément les oxygène et de nutriments dégradés, qui sont caractéristiques du microenvironnement de la tumeur in vivo, permettant l'identification des cibles de cancer nouvelles ou validation robuste des objectifs établis. De plus, notre protocole peut être appliqué à tout type de lignée cellulaire qui forme sphéroïdes et peut donc être utilisée en routine dans le milieu de la recherche sur le cancer pour les écrans de siRNA à haut débit.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
Celigo S | Nexcelom | contact company | |
Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
Benchtop centrifuge | Various | ||
Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
Mulitichannel pipette | Various |