Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
Идентификация функциональных событий водителя при раке имеет решающее значение для углубления нашего понимания биологии рака и необходимым условием для открытия следующего поколения новых мишеней для лекарственных средств. Становится очевидным , что более сложные модели рака необходимо в полной мере оценить все способствующие факторы , которые управляют туморогенез в естественных условиях и повышает эффективность новых видов лечения , которые делают переход от доклинических моделей для клинических испытаний.
Здесь мы представляем методологию для формирования однородных и воспроизводимых опухолевые сфероиды, которые могут быть подвергнуты миРНК функционального скрининга. Эти сфероиды отображать много характеристик, которые найдены в солидных опухолях, которые не присутствуют в традиционной двухмерной культуры. Покажем, что несколько часто используемых клеток рака молочной железы линии поддаются этому протоколу. Кроме того, мы обеспечиваем проверка и подтверждение принципа действия данных, использующих рака молочной железы клеточной линии ВТ474, подтверждающие ихзависимость от усиления рецептора эпидермального фактора роста HER2 и мутации фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата-3-киназы (PIK3CA) при выращивании в качестве опухолевых сфероидов. И, наконец, мы можем дополнительно исследовать и подтвердить пространственное воздействие этих зависимостей с использованием иммуногистохимии.
Солидные опухоли отображать значительное гистологическое, генетические и микро-экологическая гетерогенность внутри опухоли, которая представляет клиницистам серьезную проблему в возможность успешно лечить пациентов. Большинство моделей, используемых для идентификации новых целевых терапии не учитывают многие из этих функций. Действительно, в настоящее время целевой терапии, используемые в клинике, были разработаны в последнее десятилетие с использованием скрининговых подходы, которые основываются на линиях раковых клеток, выращенных в двумерных условиях (2D) культуры. Хотя это привело к различным успехам, такие как ингибиторы рецептора тирозинкиназы, становится очевидным , что более сложные модели рака необходимо в полной мере оценить все способствующие факторы , которые управляют туморогенез в естественных условиях и увеличению числа новых методов лечения , которые делают переход от доклинических моделей для клинических испытаний. Кроме того, теперь хорошо понятно , что системы культуры 2D не отражают вVivo поведение 1,2. Например, в плохо васкуляризируется опухолей, так как спрос на кислород и питательные вещества в микросреде опережать предложение, регионы высоких и низких поставок развиваться. Наличие низкого уровня содержания кислорода (гипоксия) в опухолях, которая была определена иммуногистохимического окрашивания опухолевых участков для установленных маркеров гипоксических , таких как карбоангидразы IX (CAIX), коррелирует с худшим клиническим исходом при раке молочной железы 3,4 Таким образом , содержащего признаки , такие как гипоксия в модели скрининга может улучшить нашу способность обнаружить новые цели наркотиков , которые будут более эффективными в естественных условиях. Действительно, успешно таргетингом агрессивные опухоли , которые содержат гипоксию является клиническим приоритетом 5.
Изменяющий традиционного скрининга 2D миРНК, в попытке более точно резюмировать элементы условий, с которыми сталкиваются раковых клеток в опухоли микроокружения, привело к идентификации некоторых генов-гопри было установлено, что важное значение для роста опухоли в естественных условиях. Они включают в себя функциональные геномные экраны , выполненные в условиях низких сывороточных 6, 7 условиях гипоксии и в комбинации 8. Например, глушение 6-фосфофрукто-2-киназа / фруктоза-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), белка, ответственного за регулирование углерода ввод гликолиза, только индуцируется апоптоз в линиях рака предстательной железы, полученных из метастаза при выращивании в условиях низкой сыворотке. Сайленсинг PFKFB4 в нормальных клеточных линиях простаты при тех же самых условиях , не имели никакого эффекта, в то время как, истощение PFKFB4 полностью абляции рост линии клеток рака простаты ксенотрансплантатов 6.
В расширенной панели линий клеток рака молочной железы, замалчивании моно-карбоксилазы транспортером 4 (MCT4) преимущественно приводило к уменьшению роста клеточной линии в условиях пониженного содержания кислорода. Эта уязвимость была подтверждена в естественных условиях при раке молочной железы клеточной линии ортотропного xenograFTS. Пожалуй, наиболее ярко, глушителей из Ацетил-КоА синтетазы 2 (ACSS2), фермент, ответственный за преобразование ацетата в ацетил-КоА, снижается рак количество клеток при питательных условиях стресса (с низким содержанием кислорода и сыворотки), но не имели практически никакого эффекта при нормальных условиях культивирования 8. Абляция ACSS2 повлияло на рост рака молочной железы и рака простаты ксенотрансплантатов , предполагающих , что градиенты питательных веществ не существует в изоляции в пределах микросреды опухоли и клетки , которые находятся в этих областях имеют важное значение для развития опухоли 8. Кроме того, ACSS2 было также установлено, что важную роль в глиобластомы и гепатоцеллюлярной карциномой 9,10, предполагая , что повышение активности ACSS2 в опухолях может быть фундаментальным механизмом , который поддерживает рост при неблагоприятных условиях.
В совокупности эти исследования доказывают , что перепросмотр условия , встречающиеся в естественных условиях и выполнения экранов миРНК позволяет для идентификации гены, необходимые для выживания рака. А также влияет 2D рост раковых клеток при питательных условиях стресса, истощения генов – мишеней в этих исследованиях ингибирует рост рака сфероид клеточной линии, отражая то , что наблюдалось в ксенотрансплантатов 6,8. Таким образом, линии раковых клеток сфероиды содержат некоторые из условий, встречающихся в микросреды опухоли, которые придают чувствительность к ACSS2 глушителей. Действительно, сфероиды отображать градиенты питательных веществ (сыворотка и кислорода), изменения рН, трехмерные (3D) межклеточных контактов, но и изменения в пролиферативной быстроты с клетками, проходящих остановку клеточного цикла и апоптоза. Примером этого может служить наличие в раковых сфероидов некротических областей, функция не найдена в традиционном 2D культуре.
раковая клетка сфероиды уже использовались в качестве более биологически соответствующих моделей для скрининга ингибиторов молекулы небольших, но это позволяет только для проверки соединения эффективности или перепрофилирования из компоunds изначально дизайн для других заболеваний 11. Современные методы скрининга сфероид не позволяют для анализа конкретного гена истощения в высокой пропускной способности высокого содержания способом. Здесь мы описываем впервые, функциональная геномика трубопровод для раскрытия конкретных зависимостей генов с использованием технологии малых интерферирующих РНК (киРНК) в раковых сфероидов клеточной линии. Мы разработали сделанную на заказ библиотеку с миРНК, направленных на 200 наиболее часто мутантных генов в раковых опухолей молочной железы человека и оценили влияние истощения гена на сфероида размера и метаболической активности в ВТ474 рака молочной железы сфероидов. Мы были в состоянии решительно и воспроизводимо обнаруживать влияние ERBB2 и PIK3CA глушителей в 3D культурах. Кроме того, мы могли бы оценить влияние истощения гена на пространственной архитектуры ВТ474 сфероидов с использованием иммуногистохимии.
Трехмерные модели рака все чаще используются для оценки эффективности известных и новых соединений, которые были разработаны для селективного уничтожения раковых клеток. Раковая клетка сфероиды структуры , которые отображают условия более аналогичные тем , которые встречаются в опухолях в естественных условиях, таким образом , соединения , которые увеличили эффективность в 3D, более вероятно , чтобы иметь эффект в естественных условиях. Тем не менее, эти методы не позволяют для идентификации потенциально новых целей, которые не были предметом разработки лекарств, которые могут иметь значительную эффективность при лечении рака.
Мы разработали миРНК функциональному геному подход, который позволил к прочному молчанием генов на срок до семи дней в раковых клеточных линий сфероидов. Есть несколько важных шагов к протоколу, которые требуют оптимизации перед тем экран миРНК может быть выполнена. Способность формировать воспроизводимые жизнеспособные сфероидов в больших масштабах имеет важное значение. Кроме того,ppropriate условия трансфекции должны быть тщательно оптимизированы. Мы предлагаем несколько различных испытания той реагентов трансфекции с соответствующим ненацеливании и убивая контроля до попытки экрана. Нам удалось показать, что несколько часто используемых клеточных линий рака молочной железы, а именно ВТ474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 и JIMT1 поддавались миРНК трансфекции. Кроме того, мы обеспечиваем проверка и подтверждение принципа действия данных скрининга 200 наиболее часто мутантных генов при раке молочной железы в ВТ474 сфероидов, подтвердили свою зависимость от амплификации HER2 и онкогенных мутаций PIK3CA. Интересно отметить, что глушение фактора транскрипции FOXO3 привело к уменьшению размеров сфероида, но не оказывает существенного влияния на жизнеспособность. FOXO3 , как известно, регулируют ответ на гипоксию, изменяя метаболическую способность раковых клеток , позволяя им адаптироваться с большей готовностью к их среде 16. Эта роль может потенциально мешать чтению жизнеспособности клеток, как он обнаруживает АТФ изобилие, Одним из основных продуктов клеточного метаболизма.
В поддержку наблюдения уменьшение сфероид размера, было показано , что глушение FOXO3 в HeLa ксенотрансплантатов ослабленный рост опухоли и индуцированный апоптоз 17. Важно отметить, что некоторые гены могут влиять на способность раковых клеток, чтобы сохранить их 3D архитектуру, которая может привести к ложных срабатываний. Например, нокдаун E-кадгерина привело к роспуску структуры сфероида ВТ474. Это уже сообщалось ранее , используя E-Cadherin целевых антител 18. Как и с любой скрининговой платформы, потенциальные цели должны быть снова просеивают с целью оценки воспроизводимости наблюдаемого эффекта. Существуют ограничения на технику, а именно переходного характера миРНК-опосредованной гена нокдаун. Устойчивые глушителей больше, чем за семь дней не было достижимо с миРНК.
Преимущество этого подхода состоит в том, что она может быть соединена с различными другими биомуческие красители не только те, которые оценивают жизнеспособность сфероид, например, давая пространственную информацию о сфероида гипоксии или мониторинга клеток, подвергающихся апоптозу. К тому же, так как сканирование планшет-ридер относительно быстрый и неинвазивный, влияние киРНК на сфероид размера может быть оценена в течение долгого времени, а не только на экспериментальной конечной точке. Действительно, мы в настоящее время изучают некоторые из этих проспектов в рамках нашего скрининга трубопровода. Альтернативный подход, который использует 3D культур для идентификации новых зависимостей является использование химических библиотек, ингибирующих либо широкий круг задач или конкретных семейств белков. В самом деле, Bitler и др. использовали этот целевой подход для идентификации синтетического взаимодействия летальности между статусом ARID1A и ингибиторов Ezh2 в яичниках четких карцином 19. Открытие технологии редактирования гена CRISPR-cas9 также позволило для развития генетических экранов в Органоид культурах , так и в естественных условиях. Тем не менее, тего подход зависит от наличия соответствующих технических средств животного происхождения и могут стоить непомерно 20.
В заключение, мы считаем , что мы наметили протокол , который более точно моделирует кислорода и питательных градиенты, которые являются особенности микросреды опухоли в естественных условиях, что позволяет для идентификации новых мишеней рака или надежной проверки установленных целевых показателей . Кроме того, наш протокол может быть применен к любому типу клеток линии, образующей сфероиды и, следовательно, может быть, которые обычно используются в научно-исследовательском сообществе рака высопроизводительный экранов киРНК.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
Celigo S | Nexcelom | contact company | |
Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
Benchtop centrifuge | Various | ||
Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
Mulitichannel pipette | Various |