Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
A identificação de eventos excitador funcionais no câncer é fundamental para aprofundar nossa compreensão da biologia do câncer e indispensável para a descoberta da próxima geração de novos alvos de drogas. Está se tornando evidente que os modelos mais complexos de câncer são obrigados a apreciar plenamente os fatores que contribuem para que impulsionam tumorigênese in vivo e aumentar a eficácia de novas terapias que fazem a transição de modelos pré-clínicos para ensaios clínicos.
Aqui apresenta-se uma metodologia para a geração de esferóides tumorais uniforme e reprodutível, que pode ser submetido a triagem funcional de siRNA. Estes esferóides exibir muitas características que são encontradas em tumores sólidos que não estão presentes na cultura bidimensional tradicional. Mostramos que várias linhas celulares de cancro da mama comumente utilizados são passíveis de este protocolo. Além disso, nós fornecemos a prova de princípio de dados utilizando a linha de células de cancro da mama BT474, confirmando a suadependência de amplificação do receptor do factor de crescimento epidérmico e HER2 mutação de fosfatidilinositol-4,5-bifosfato-3-quinase (PIK3CA), quando crescidas como tumores esferóides. Finalmente, somos capazes de investigar e confirmar o impacto espacial destas dependências usando imuno-histoquímica.
Os tumores sólidos exibir histológica significativa, a heterogeneidade genética intra-tumoral e micro-ambientais, que apresenta os clínicos com um desafio significativo na capacidade de tratar pacientes com sucesso. A maioria dos modelos utilizados para identificar novas terapias direcionadas não incorporam muitos desses recursos. De facto, as terapias correntes orientadas utilizados na clínica foram desenvolvidos na década passada utilizando abordagens de rastreio que se baseiam em linhas celulares de cancro cultivadas sob condições bidimensionais (2D) de cultura. Embora este trouxe vários sucessos, tais como inibidores do receptor tirosina quinase, está se tornando evidente que os modelos mais complexos de câncer são obrigados a apreciar plenamente os fatores que contribuem para que impulsionam tumorigênese in vivo e aumentar o número de novas terapias que fazem a transição de modelos pré-clínicos para ensaios clínicos. Além disso, é agora bem apreciado que os sistemas de cultura 2D não reflectem emvivo comportamento 1,2. Por exemplo, em tumores vascularizados mal, como a procura de oxigénio e nutrientes, no microambiente superar a oferta, as regiões de alta e baixa entregas desenvolver. A presença de baixos níveis de oxigênio (hipóxia) em tumores, como detectado pela coloração imuno-histoquímica de secções de tumor para os marcadores de hipóxia estabelecidos, como anidrase carbônica IX (CAIX), correlaciona-se com pior evolução clínica no cancro da mama 3,4 características Assim que incorporem tais como hipoxia em modelos de triagem pode melhorar a nossa capacidade de descobrir alvos de drogas novas que serão mais eficazes in vivo. Na verdade, dirigidas com sucesso tumores agressivos que contenham hipóxia é uma prioridade clínica 5.
A alteração de rastreio tradicional 2D siRNA, numa tentativa de recapitular com mais precisão os elementos de condições encontradas por células cancerosas no microambiente tumoral, levou à identificação de vários genes thno foram encontrados como sendo importantes para o crescimento do tumor in vivo. Estes incluem telas de genômica funcional realizadas em condições séricos 6, condições de hipóxia 7 e 8 em combinação. Por exemplo, o silenciamento de 6-Phosphofructo-2-Quinase / frutose-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), uma proteína responsável pela regulação da glicólise entrar carbono, somente induziu a apoptose em linhas de cancro da próstata derivadas de metástases, quando cultivada em baixo teor de soro. O silenciamento de PFKFB4 em linhas de células da próstata normais e sob as mesmas condições não teve nenhum efeito, ao passo que, a depleção de PFKFB4 ablated completamente o crescimento de linha celular de cancro da próstata de xenoenxertos 6.
Em um painel alargado de linhas celulares de cancro da mama, o silenciamento de mono-carboxilase transportador 4 (MCT4) preferencialmente conduzido para a redução do crescimento da linha de células sob condições de baixo teor de oxigénio. Esta vulnerabilidade foi validado in vivo no cancro da mama linha de células orthotropic xenografts. Talvez o mais impressionante, silenciando de acetil-CoA sintetase 2 (ACSS2), uma enzima responsável pela conversão de acetato em acetil-CoA, número reduzido de câncer de células sob condições de estresse de nutrientes (baixa de oxigênio e soro), mas teve pouco ou nenhum efeito em condições de cultura normais 8. A ablação de ACSS2 impacto no crescimento de xenoenxertos de cancro da próstata e da mama, sugerindo que os gradientes de nutrientes não existem no isolamento dentro do microambiente do tumor e que as células que residem nestas regiões são essenciais para a progressão do tumor 8. Além disso, também ACSS2 verificou-se ser importante no glioblastoma e carcinoma hepatocelular 9,10, sugerindo que o aumento da actividade ACSS2 em tumores pode ser um mecanismo fundamental que suporta o crescimento sob condições desfavoráveis.
Colectivamente, estes estudos demonstram que recapitulando as condições encontradas in vivo e realizar telas siRNA permite a identificação de genes essenciais para a sobrevivência de câncer. Como bem como tendo impacto sobre o crescimento de células de cancro 2D nutrientes sob condições de stress, o esgotamento dos genes alvo nestes estudos inibiu o crescimento do esferóide linha celular de cancro, à semelhança do que foi observado em xenoenxertos tumorais 6,8. Assim, esferóides linha celular de cancro conter várias das condições encontradas no microambiente tumoral que conferem sensibilidade ao silenciamento ACSS2. Com efeito, esferóides apresentar gradientes de nutrientes e oxigénio (soro), alterações no pH, tridimensional de contacto célula-célula (3D), mas também, alterações na celeridade proliferativa com as células submetidas a paragem do ciclo celular e apoptose. Isto é exemplificado pela presença de esferóides de cancro de regiões necróticas, uma característica não encontrada na cultura 2D tradicional.
esferóides de células de cancro já foram utilizados como modelos mais biologicamente relevantes para rastrear inibidores de moléculas pequenas, mas isto só permite a validação da eficácia do composto ou reaproveitamento de COMPOunds originalmente projetar para outras doenças 11. métodos de rastreio esferóide actuais não permitem a análise da depleção de gene específico de uma de alto rendimento de modo de alta conteúdo. Aqui, nós descrevemos, pela primeira vez, um oleoduto genómica funcional para a descoberta de genes específicos dependências utilizando a tecnologia de pequeno ARN interferente (siRNA) em esferóides linha celular de cancro. Nós projetamos uma biblioteca sob medida com siRNAs segmentação dos 200 genes mais frequentemente mutado em cancros da mama humanos e avaliou o impacto do esgotamento gene do tamanho do esferóide e da atividade metabólica em BT474 esferóides de câncer de mama. Fomos capazes de detectar de forma robusta e reproduzível do impacto da ErbB2 e PIK3CA silenciando em culturas 3D. Além disso, pode-se avaliar o impacto da depleção do gene na arquitectura espacial dos esferóides BT474 usando imuno-histoquímica.
Modelos tridimensionais de cancro estão a ser cada vez mais utilizadas para avaliar a eficácia de compostos conhecidos e novos, que foram concebidos para matar selectivamente as células cancerosas. Esferóides de células cancerosas são estruturas que apresentam condições mais semelhantes às encontradas em tumores in vivo, assim, compostos que aumentaram a eficácia em 3D são mais propensos a ter um efeito in vivo. No entanto, essas modalidades não permitem a identificação de novos alvos potencialmente que não tenham sido objecto de desenho de drogas que poderia ter considerável eficácia no tratamento do cancro.
Desenvolvemos um siRNA abordagem genómica funcional que permitiu o silenciamento do gene durável por até sete dias em esferóides linha de células cancerosas. Existem vários passos críticos para o protocolo que requerem optimização antes de uma tela de siARN pode ser realizada. A capacidade para formar esferóides viáveis reprodutíveis em larga escala é essencial. Além disso, umacondições de transfecção ppropriate deve ser rigorosamente optimizada. Sugerimos testando vários reagentes de transfecção diferentes com não-segmentação adequada e matando os controles antes de tentar a tela. Fomos capazes de mostrar que várias linhas celulares de cancro da mama comumente utilizados, ou seja, BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 e JIMT1 eram passíveis de siRNA transfecção. Além disso, nós fornecemos a prova de princípio de dados de rastreio dos 200 genes mais frequentemente mutado no cancro da mama em esferóides BT474, confirmaram a sua dependência de amplificação de HER2 e mutação oncogénica de PIK3CA. Curiosamente, o silenciamento do factor de transcrição FOXO3 resultou numa redução do tamanho do esferóide mas nenhum efeito significativo sobre a viabilidade. FOXO3 é conhecida para regular a resposta à hipóxia, alterando a capacidade metabólica das células cancerosas que lhes permite adaptar-se mais facilmente ao seu ambiente 16. Este papel poderia potencialmente interferir com a leitura viabilidade celular, uma vez que detecta ATP abundância, Um dos principais produtos do metabolismo celular.
Em apoio da observação de uma redução no tamanho do esferóide, foi demonstrado que o silenciamento de FOXO3 HeLa em xenoenxertos auditivos crescimento tumoral e induziu apoptose 17. É importante notar que alguns genes podem afectar a capacidade das células cancerosas para reter a sua arquitectura 3D, o que poderia resultar em falsos positivos. Por exemplo, knockdown da caderina-E resultou na dissolução da estrutura esferóide BT474. Esta havia sido relatado usando E-caderina alvo anticorpos 18. Tal como acontece com qualquer plataforma de triagem, alvos potenciais devem ser novamente testados para avaliar a reprodutibilidade do efeito observado. Existem limitações para a técnica, ou seja, a natureza transitória do silenciamento de genes mediada por siRNA. Sustentados silenciando mais de sete dias não era possível com siRNA.
A vantagem desta abordagem é que ele pode ser acoplado com vários outros biomacorantes tricas e não apenas aqueles que avaliar a viabilidade esferóide, por exemplo, dando informação espacial de hipóxia esferóide ou células monitoramento em apoptose. Além disso, porque os scans leitor de placas são relativamente rápida e não-invasiva, o impacto de ARNic em tamanho esferóide pode ser avaliado ao longo do tempo em vez de apenas no ponto final experimental. Na verdade, estamos a explorar várias dessas avenidas dentro do nosso pipeline de rastreio. Uma abordagem alternativa que utiliza culturas 3D para identificar novos dependências é o uso de bibliotecas químicas que inibem qualquer um de uma ampla gama de alvos particulares ou famílias de proteínas. Com efeito, Bitler et ai. utilizou essa abordagem orientada para identificar a interação letalidade sintética entre o estado ARID1A e inibidores EZH2 no ovário carcinoma de células claras 19. A descoberta da tecnologia de edição gene CRISPR-Cas9 também permitiu o desenvolvimento de telas genéticos em culturas organ�de e in vivo. No entanto, tsua abordagem depende da existência de instalações para animais apropriados e pode ser custo proibitivo 20.
Em conclusão, acreditamos que temos delineado um protocolo que mais precisamente modelos o oxigênio e nutrientes gradientes, que são características do microambiente do tumor in vivo, permitindo a identificação de alvos de câncer de romance ou de validação robusta de metas estabelecidas. Além disso, o protocolo pode ser aplicado a qualquer tipo de linha de células que se forma esferóides e, por conseguinte, pode ser utilizado rotineiramente na comunidade de investigação do cancro para telas de ARNsi de alto rendimento.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
Celigo S | Nexcelom | contact company | |
Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
Benchtop centrifuge | Various | ||
Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
Mulitichannel pipette | Various |