Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
Die Identifizierung von funktionellen Fahrer Ereignisse in der Krebstherapie ist von zentraler Bedeutung, unser Verständnis der Krebsbiologie und unverzichtbar für die Entdeckung der nächsten Generation neuartiger Medikamente zu fördern. Es zeichnet sich ab, dass komplexere Modelle von Krebs sind vollständig erforderlich , um die Faktoren zu schätzen wissen , die Tumorentstehung in vivo fahren und die Wirksamkeit neuer Therapien erhöhen, die den Übergang von der präklinischen Modellen zu klinischen Studien zu machen.
Hier präsentieren wir eine Methode zur Erzeugung von gleichmäßigen und reproduzierbaren Tumorsphäroide, die siRNA funktionelles Screening unterzogen werden kann. Diese Sphäroiden zeigen viele Merkmale, die in soliden Tumoren gefunden werden, die in der traditionellen Kultur Zwei-Dimension nicht vorhanden sind. Wir zeigen, dass mehrere häufig verwendete Brustkrebszelllinien zu diesem Protokoll zugänglich sind. Darüber hinaus stellen wir Proof-of-Principle-Daten, die die Brustkrebszelllinie BT474 verwendet wird, bestätigt ihreAbhängigkeit von Verstärkung des Faktor-Rezeptor des epidermalen Wachstums HER2 und Mutation von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat-3-Kinase (PIK3CA), wenn sie als Tumorsphäroide gewachsen. Schließlich sind wir die räumliche Wirkung dieser Abhängigkeiten Immunhistochemie weiter zu untersuchen können und bestätigen.
Solide Tumoren zeigen signifikante histologischen, genetischen und mikroUmwelt intratumorale Heterogenität, die Patienten in der Lage, Klinikern eine große Herausforderung stellt erfolgreich zu behandeln. Die Mehrzahl der Modelle Roman zu identifizieren, zielgerichtete Therapien integrieren nicht viele dieser Funktionen. Tatsächlich aktuellen zielgerichtete Therapien in der Klinik verwendet wurden in den letzten zehn Jahren beschäftigt Screening Ansätze entwickelt, die unter zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen auf Krebszelllinien angewiesen gezüchtet. Obwohl dies über verschiedene Erfolge, wie Rezeptor – Tyrosin – Kinase – Inhibitoren gebracht hat, wird immer offensichtlich , dass komplexere Modelle von Krebs erforderlich sind , um vollständig die Faktoren erkennen , die Tumorigenese in vivo und erhöhen die Anzahl neuer Therapien fahren , die den Übergang von vorklinischen Modellen zu klinischen Studien. Darüber hinaus ist es nun auch ersichtlich , dass 2D – Kultursysteme zu reflektieren scheiternvivo Verhalten 1,2. Zum Beispiel in schlecht vaskularisierten Tumoren, da die Nachfrage nach Sauerstoff und Nährstoffen in der Mikroumgebung überflügeln Versorgung, Regionen mit hoher und niedriger Lieferungen entwickeln. Die Anwesenheit von geringen Sauerstoff (Hypoxie) in Tumoren, wie durch die immunhistochemische Färbung von Tumorschnitten für etablierte hypoxischen Marker wie Carboanhydrase IX (CAIX) detektiert wird , korreliert mit einem schlechteren klinischen Ergebnis in Brustkrebs 3,4 Somit beinhaltet Funktionen wie Hypoxie in Screening – Modelle verbessern können unsere Fähigkeit , neue Angriffspunkte für Medikamente zu entdecken , die in vivo wirksamer sein wird. Tatsächlich erfolgreich Targeting aggressive Tumoren , die Hypoxie enthalten ist eine klinische Priorität 5.
Die Verfälschung von herkömmlichen 2D-siRNA-Screening, in einem Versuch, genauer Elemente der von den Krebszellen in der Tumormikroumgebung angetroffen Bedingungen rekapitulieren, hat zur Identifizierung mehrerer Gene führte that wurden für das Tumorwachstum in vivo wichtig erwiesen. Dazu gehören funktionelle Genom Bildschirme durchgeführt unter niedrigen Serum – Bedingungen 6, hypoxischen Bedingungen 7 und in Kombination 8. Zum Beispiel silencing von 6-Phosphofructo-2-Kinase / Fruktose-2,6-bisphosphatase 4 (PFKFB4), ein Protein verantwortlich für die Regulierung Kohlenstoff eintritt Glykolyse, nur apoptosis in Prostatakarzinom Linien von Metastasierung abgeleitet induziert, wenn in niedrigen Serum gezüchtet. Silencing von PFKFB4 in normalen Prostatazelllinien unter den gleichen Bedingungen hatte keine Wirkung, während Erschöpfung der PFKFB4 vollständig das Wachstum von Prostata – Krebszelllinie Xenotransplantaten 6 abgetragenen.
In einer erweiterten Gruppe von Brustkrebs-Zelllinien, führte das Silencing von mono-Carboxylase Transporter 4 (MCT4) bevorzugt zur Verringerung der Zelllinie Wachstum unter den Bedingungen der niedrigen Sauerstoff. Diese Schwachstelle wurde in vivo in Brustkrebs-Zelllinie orthotroper xenogra validiertfts. Vielleicht auffallend meisten Silencing von Acetyl-CoA-Synthetase-2 (ACSS2), ein Enzym, das zur Umwandlung von Acetat in Acetyl-CoA, reduziert Krebszellzahl unter Nährstoffstressbedingungen (niedrige Sauerstoff und Serum), aber hatte wenig oder keine Wirkung unter normalen Kulturbedingungen 8. Abtragung von ACSS2 beeinflusst das Wachstum von Brust- und Prostatakrebs Xenotransplantaten was darauf hindeutet , dass die Nährstoff Gradienten existieren nicht isoliert in der Tumor – Mikroumgebung und dass Zellen , die 8 für die Tumorprogression wesentlich in diesen Regionen befinden sind. Darüber hinaus 9,10, was darauf hindeutet , dass eine erhöhte ACSS2 Aktivität in Tumoren könnte ein grundlegender Mechanismus sein , dass das Wachstum unter ungünstigen Bedingungen unterstützt als wichtig bei Glioblastom und hepatozellulären Karzinomen ACSS2 wurde auch gefunden.
Zusammengefasst beweisen diese Studien , dass die Bedingungen in vivo angetroffen rekapituliert und Durchführung siRNA – Bildschirme für die Identifizierung von g erlaubtenen von wesentlicher Bedeutung für Krebs Überleben. Neben 2D – Wachstum von Krebszellen unter Nährstoffstressbedingungen beeinflussen, Erschöpfung von Zielgenen in diesen Studien gehemmt Sphäroid Wachstum Krebszelllinie, Spiegeln , was in Tumorxenografte 6,8 beobachtet wurde. So enthalten Krebszelllinie Sphäroiden mehrere der Bedingungen im Tumormikromilieu angetroffen, die Empfindlichkeit gegenüber ACSS2 Silencing verleihen. Tatsächlich zeigen Sphäroide Nährstoff Gradienten (Serum und Sauerstoff), Veränderungen in pH, dreidimensionale (3D) Zell-Zell-Kontakt, sondern auch Veränderungen in proliferative celerity mit Zellen, Zellzyklusarrest und Apoptose unterzogen. Dies wird veranschaulicht durch die Anwesenheit in Krebs Sphäroide nekrotischer Bereiche, ein Merkmal nicht in herkömmlichen 2D-Kultur gefunden.
kleine Molekül-Inhibitoren zu screenen, aber dies ermöglicht nur für die Validierung der Verbindung Wirksamkeit oder die Umwidmung von Kompo Krebszelle Sphäroiden wurden bereits als biologisch relevanten Modelle verwendet wordenunds ursprünglich entwickelt für andere Krankheiten 11. Strom Sphäroid Screeningverfahren für die Analyse von spezifischen Gens Verarmungs nicht in einem Hochdurchsatz-Hoch Gehalt Weise ermöglichen. Hier beschreiben wir zum ersten Mal, eine funktionelle Genomik-Pipeline für die Aufdeckung spezifischer Gen-Abhängigkeiten unter Verwendung von small interfering RNA (siRNA) Technologie in der Krebszelllinie Sphäroiden. Wir haben eine maßgeschneiderte Bibliothek mit siRNAs die 200 am häufigsten mutierten Gene in menschlichen Brustkrebs und bewertet die Auswirkungen der Gen-Depletion auf Sphäroid Größe und die metabolische Aktivität in BT474 Brustkrebs Sphäroiden Targeting. Wir konnten robust und reproduzierbar die Auswirkungen von ERBB2 und PIK3CA-Silencing in 3D Kulturen erkennen. Außerdem konnten wir die Auswirkungen von Gen Depletion auf die räumliche Architektur von BT474 Sphäroide beurteilen Immunhistochemie.
Dreidimensionale Modelle von Krebs werden zunehmend eingesetzt, um die Wirksamkeit von bekannten und neuen Verbindungen zu bewerten, die entworfen wurden, um selektiv Krebszellen abzutöten. Krebszelle Sphäroiden sind Strukturen , die Bedingungen mehr ähnlich denen begegnet in Tumoren in vivo zeigen, so dass Verbindungen , die Wirksamkeit in 3D erhöht haben , sind eher eine Wirkung in vivo zu haben. Allerdings sind diese Modalitäten nicht zur Identifizierung von potentiell neuen Targets ermöglichen, die nicht Gegenstand der Wirkstoffdesign bekannt ist, dass erhebliche Wirksamkeit bei der Behandlung von Krebs haben kann.
Wir entwickelten eine siRNA funktionellen Genomik Ansatz, der für bis zu sieben Tage in der Krebszelllinie Sphäroiden für langlebige Gen-Silencing erlaubt. Es gibt mehrere wichtige Schritte des Protokolls, die eine Optimierung erfordern, bevor ein siRNA-Bildschirm durchgeführt werden kann. Die Fähigkeit, in einem großen Maßstab reproduzierbar tragfähige Sphäroiden zu bilden, ist wesentlich. Darüber hinaus ist einppropriate Transfektionsbedingungen sollte konsequent optimiert werden. Wir schlagen vor, trialing verschiedene Transfektionsreagenzien mit geeigneten nicht-Targeting und Kontrollen vor dem Versuch den Bildschirm zu töten. Wir konnten zeigen, dass viele häufig verwendete Brustkrebs-Zelllinien zu zeigen, nämlich BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 und JIMT1 zu siRNA-Transfektion zugänglich waren. Darüber hinaus haben wir Proof-of-Prinzip liefern Daten Screening der 200 am häufigsten mutierten Gene bei Brustkrebs in BT474 Sphäroiden, bestätigt ihre Abhängigkeit von Amplifikation von HER2 und onkogene Mutation von PIK3CA. Interessanterweise silencing des Transkriptionsfaktors FOXO3 führte zu einer Verringerung in Sphäroid Größe, aber keine signifikante Wirkung auf die Lebensfähigkeit. FOXO3 ist bekannt , die als Reaktion auf Hypoxie zu regulieren, die metabolische Kapazität von Krebszellen , so dass sie zu verändern 16 leichter an ihre Umgebung anzupassen. Diese Rolle könnte möglicherweise mit der Lebensfähigkeit der Zellen Lesen stören, wie es ATP Fülle erkennt, Einer der wichtigsten Produkte des Zellstoffwechsels.
Zur Unterstützung der Beobachtung einer Reduktion in Sphäroid Größe wurde gefunden , dass Silencing FOXO3 in HeLa gezeigt, Tumorwachstum und Apoptose induziert 17 beeinträchtigt Xenotransplantaten. Es ist wichtig zu beachten, dass einige Gene die Fähigkeit von Krebszellen beeinflussen können ihre 3D-Architektur zu erhalten, die in False Positives führen könnte. Beispielsweise Zuschlags von E-Cadherin in Folge der Auflösung von BT474 Sphäroid Struktur. Dies hatte zuvor berichtet E-Cadherin – Antikörper durch gezielte 18. Wie bei jedem Screening-Plattform sollten potenzielle Ziele, um die Reproduzierbarkeit der Wirkung beobachtet zu beurteilen, werden gescreent. Es gibt Grenzen für die Technik, nämlich die vorübergehende Natur der siRNA-vermittelten Knock-Down. Sustained zum Schweigen zu bringen länger als sieben Tage nicht erreichbar mit siRNA.
Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es mit verschiedenen anderen Biom gekoppelt werden kann,tric Farbstoffe diese nicht nur die Sphäroid Lebensfähigkeit beurteilen zu können, zum Beispiel, räumliche Informationen von Sphäroid Hypoxie zu geben oder Apoptose durch Überwachung Zellen. Darüber hinaus, weil die Plattenleser Scans relativ schnell und nicht-invasiv sind, kann die Wirkung von siRNAs auf Sphäroid Größe im Laufe der Zeit nicht nur an der experimentellen Endpunkt bewertet werden. Tatsächlich untersuchen wir derzeit mehrere dieser Möglichkeiten innerhalb unserer Screening-Pipeline. Ein alternativer Ansatz, die 3D-Kulturen nutzt neue Abhängigkeiten zu identifizieren, ist die Verwendung von chemischen Bibliotheken, die entweder ein breites Spektrum von Zielen oder bestimmte Familien von Proteinen hemmen. Tatsächlich Bitler et al. Diese gezielte Ansatz genutzt , um die synthetische Letalität Interaktion zwischen ARID1A Status und EZH2 – Inhibitoren in ovarian klarzelligen Karzinomen 19 zu identifizieren. Die Entdeckung des CRISPR-Cas9 Gen Bearbeitungstechnologie hat zur Entwicklung von genetischen Screens in organoiden Kulturen und in vivo ebenfalls erlaubt. Jedoch tSein Ansatz ist auf mit geeigneten Tieranlagen abhängig und 20 unerschwinglich teuer werden kann.
Abschließend glauben wir , dass wir ein Protokoll dargelegt haben , dass genauer modelliert die Sauerstoff- und Nährstoff Gradienten, die Merkmale der Tumor – Mikroumgebung in vivo sind, so dass für die Identifizierung von neuen Targets bei Krebs oder robuste Validierung von festgelegten Zielen. Außerdem kann unser Protokoll für jede Art von Zelllinie angewendet werden, die Sphäroide und somit bildet, kann routinemäßig in der Gemeinschaft der Krebsforschung für siRNA Hochdurchsatz-Screens verwendet werden.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
Celigo S | Nexcelom | contact company | |
Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
Benchtop centrifuge | Various | ||
Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
Mulitichannel pipette | Various |