Embriyonik ve Larva Zebra Balıklarında Yüksek Çözünürlüklü Hücre Nakli

Hücre nakli, gelişim biyolojisinde temel bir teknik olarak uzun ve köklü bir geçmişe sahiptir. 20^{. yüzyılın} başlarında, transplantasyon da dahil olmak üzere gelişim sürecini bozmak için fiziksel manipülasyonlar kullanan yaklaşımlar, embriyolojiyi gözlemsel bir bilimden deneysel bir bilime dönüştürdü ^1,2. Dönüm noktası niteliğindeki bir deneyde, Hans Spemann ve Hilde Mangold, bir semender embriyosunun dorsal blastopore dudağını ektopik olarak bir konakçı embriyonun karşı tarafına nakletti ve yakındaki dokuyu ikincil bir vücut ekseni³ oluşturmaya teşvik etti. Bu deney, hücrelerin diğer hücreleri belirli kaderleri benimsemeye teşvik edebileceğini gösterdi ve daha sonra transplantasyon, gelişim biyolojisinde yeterlilik ve hücre kaderi belirleme, hücre soyu, indüktif yetenek, plastisite ve kök hücre gücü ile ilgili kritik soruları sorgulamak için güçlü bir yöntem olarak geliştirildi ^1,4,5.

Daha yeni bilimsel gelişmeler, transplantasyon yaklaşımının gücünü genişletmiştir. 1969’da Nicole Le Douarin’in nükleolar boyamanın bıldırcın-civciv kimeralarındaki köken türlerini ayırt edebileceğini keşfetmesi, nakledilen hücrelerin ve soylarının izlenmesine izin verdi⁶. Bu kavram daha sonra transgenik floresan belirteçlerin ve gelişmiş görüntüleme tekniklerinin⁵ ortaya çıkmasıyla güçlendirildi ve hücre kaderini ^6,7 izlemek, kök hücreleri ve güçlerini ^8,9 tanımlamak ve beyin gelişimi sırasında hücre hareketlerini izlemek^{için kullanıldı 10}. Ek olarak, moleküler genetiğin yükselişi, gelişimsel faktörlerin özerk ve özerk olmayan işlevlerinin kesin diseksiyonunu destekleyerek, farklı genotiplerin konakçıları ve donörleri arasındaki transplantasyonu kolaylaştırdı¹¹.

Transplantasyon ayrıca, rejenerasyon dokularının büyümesini ve şekillenmesini düzenleyen hücresel kimlikleri ve etkileşimleri açıklayarak, özellikle planaryalar ve aksolotl gibi güçlü rejeneratif yeteneklere sahip organizmalarda rejenerasyon çalışmalarına önemli katkılarda bulunmuştur. Nakil çalışmaları, potens¹², mekansal modelleme^13,14, spesifik dokuların^{katkıları 15,16} ve rejenerasyonda hücresel hafıza^{için roller 12,17} ilkelerini ortaya koymuştur.

Zebra balığı, korunmuş genetik programları, yüksek genetik izlenebilirliği, dış döllenmesi, büyük kavrama boyutu ve optik netliği nedeniyle sinir sistemi de dahil olmak üzere gelişim ve yenilenme çalışmaları için önde gelen bir omurgalı modelidir 18,19,20. Zebra balığı ayrıca erken gelişim aşamalarında transplantasyona oldukça uygundur. En belirgin yaklaşım, mozaik hayvanlar oluşturmak için etiketli bir donör embriyodan hücrelerin blastula veya gastrula aşamasında bir konakçı embriyoya nakledilmesidir. Blastula aşaması sırasında nakledilen hücreler, epiboli başladığında dağılacak ve dağılacak ve embriyo²¹ boyunca etiketli hücreler ve dokulardan oluşan bir mozaik üretecektir. Gastrula nakilleri, kalkan oluştuğu ve A-P ve D-V eksenleri belirlenebildiği için nakledilen hücrelerin kaba bir kader haritasına göre bir miktar hedeflenmesine izin verir²¹. Elde edilen mozaikler, genlerin hücreye özerk bir şekilde hareket edip etmediğini belirlemede, hücre bağlılığını test etmede ve gelişim boyunca doku hareketini ve hücre göçünü haritalamada^{değerli olmuştur 5,11}. Mozaik zebra balığı, elektroporasyon²², rekombinasyon²³ ve F0 transgenezi²⁴ ve mutajenez²⁵ dahil olmak üzere çeşitli şekillerde üretilebilir, ancak transplantasyon, uzay, zaman, hücre sayısı ve türlerinde en büyük manipüle edilebilirliği ve hassasiyeti sağlar. Zebra balığı transplantasyonunun mevcut durumu, spinal motor nöronların ^26,27, retinal ganglion hücrelerinin ^28,29 ve döllenmeden sonraki ilk 10-30 saat içinde nöral krest hücrelerinin transplantasyonu (hpf)30 ve yetişkin zebra balıklarında hematopoietik ve tümör hücrelerinin^{nakli dahil} olmak üzere birkaç istisna dışında, erken aşamalarda progenitör hücrelerle büyük ölçüde sınırlıdır (hpf)³⁰ ve yetişkin zebra balıklarında hematopoietik ve tümör hücrelerinin ^5,31. Transplantasyon yöntemlerini geniş bir yaş aralığına, farklılaşma aşamalarına ve hücre tiplerine genişletmek, bu yaklaşımın gelişimsel ve rejeneratif süreçler hakkında bilgi sağlama gücünü büyük ölçüde artıracaktır.

Burada, zebra balığı embriyolarında ve larvalarında döllenmeden en az 7 gün sonrasına kadar etkili olan yüksek çözünürlüklü hücre nakli için esnek ve sağlam bir teknik gösteriyoruz. Hedef dokularda floresan proteinleri eksprese eden transgenik konakçı ve donör balıklar, tek hücreleri çıkarmak ve bunları mükemmele yakın uzamsal ve zamansal çözünürlükle nakletmek için kullanılabilir. Zebra balığı embriyolarının ve larvalarının optik berraklığı, nakledilen hücrelerin, konakçı hayvan gelişirken veya yenilenirken canlı olarak görüntülenmesine olanak tanır. Bu yaklaşım daha önce uzay-zamansal sinyal dinamiklerinin embriyo^32’de nöronal kimliği ve akson rehberliğini nasıl etkilediğini incelemek ve larva balıklarında³³ rejenerasyon sırasında içsel ve dışsal faktörlerin akson rehberliğini teşvik ettiği mantığı incelemek için kullanılmıştır. Burada farklılaşmış nöronların transplantasyonuna odaklanırken, yöntemimiz gelişim ve rejenerasyondaki soruları ele almak için birçok aşamada ve dokuda hem farklılaşmamış hem de farklılaşmış hücre tiplerine yaygın olarak uygulanabilir.