השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

להשתלת תאים יש היסטוריה ארוכה ורבת קומות כטכניקה בסיסית בביולוגיה התפתחותית. בסביבות תחילת המאה^ה-20, גישות המשתמשות במניפולציות פיזיות כדי להפריע לתהליך ההתפתחותי, כולל השתלות, הפכו את האמבריולוגיה ממדע תצפיתי למדע ניסיוני ^1,2. בניסוי פורץ דרך אחד, הנס ספמן והילדה מנגולד השתילו באופן אקטופי את שפת הבלסטופור הגבי של עובר סלמנדרה בצד הנגדי של עובר פונדקאי, וגרמו לרקמה הסמוכה ליצור ציר גוף משני³. ניסוי זה הראה כי תאים יכולים לגרום לתאים אחרים לאמץ גורלות מסוימים, וכתוצאה מכך, ההשתלה התפתחה כשיטה רבת עוצמה לחקר שאלות קריטיות בביולוגיה התפתחותית לגבי כשירות וקביעת גורל התא, שושלת תאים, יכולת השראתית, פלסטיות ועוצמת תאי גזע ^1,4,5.

התפתחויות מדעיות עדכניות יותר הרחיבו את כוחה של גישת ההשתלה. בשנת 1969, תגליתה של ניקול לה דוארין כי צביעת גרעין יכולה להבחין בין מינים של מוצא בכימרות שליו וגוזלים אפשרה מעקב אחר תאים מושתלים וצאצאיהם⁶. רעיון זה הועצם מאוחר יותר על ידי הופעתם של סמנים פלואורסצנטיים טרנסגניים וטכניקות הדמיה מתקדמות⁵, והוא מונף כדי לעקוב אחר גורל התא ^6,7, לזהות תאי גזע ואת עוצמתם ^8,9, ולעקוב אחר תנועות תאים במהלך התפתחות המוח¹⁰. בנוסף, עליית הגנטיקה המולקולרית אפשרה השתלות בין מארחים ותורמים של גנוטיפים שונים, ותמכה בדיסקציה מדויקת של פונקציות אוטונומיות ולא אוטונומיות של גורמים התפתחותיים¹¹.

השתלות תרמו גם תרומות חשובות לחקר ההתחדשות, במיוחד באורגניזמים בעלי יכולות התחדשות חזקות כגון פלנרים ואקסולוטלים, על ידי הבהרת הזהויות התאיות והאינטראקציות המווסתות את הצמיחה והדפוס של רקמות מתחדשות. מחקרי השתלות גילו עקרונות של עוצמה¹², תבניות מרחביות ^13,14, תרומות של רקמות ספציפיות ^15,16, ותפקידים לזיכרון תאי ^12,17 בהתחדשות.

דגי זברה הם מודל חולייתי מוביל לחקר התפתחות והתחדשות, כולל במערכת העצבים, בשל התוכניות הגנטיות השמורות שלהם, יכולת גנטית גבוהה, הפריה חיצונית, גודל מצמד גדול ובהירות אופטית 18,19,20. דגי זברה גם נוחים מאוד להשתלה בשלבים התפתחותיים מוקדמים. הגישה הבולטת ביותר היא השתלת תאים מעובר תורם מסומן לעובר פונדקאי בשלב הבלסטולה או הגסטרולה ליצירת חיות פסיפס. תאים שהושתלו בשלב הבלסטולה יתפזרו ויתפזרו עם תחילת האפיבולי, וייצרו פסיפס של תאים ורקמות מסומנים על פני העובר²¹. השתלות גסטרולה מאפשרות מיקוד מסוים של תאים מושתלים על פי מפת גורל גסה כאשר המגן נוצר וניתן לקבוע את צירי A-P ו- D-V²¹. הפסיפסים שנוצרו היו בעלי ערך בקביעה אם גנים פועלים באופן אוטונומי של התא, בבדיקת מחויבות התא ובמיפוי תנועת רקמות ונדידת תאים במהלך ההתפתחות ^5,11. דגי זברה פסיפס יכולים להיווצר במספר דרכים, כולל אלקטרופורציה²², רקומבינציה²³, טרנסגנזה F0²⁴ ומוטגנזה²⁵, אך השתלה מספקת את המניפולציה והדיוק הגדולים ביותר במרחב, בזמן ובמספר וסוגי התאים. המצב הנוכחי של השתלת דגי זברה מוגבל במידה רבה לתאי אב בשלבים מוקדמים, עם כמה יוצאים מן הכלל, כולל השתלת נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה^26,27, תאי גנגליון רשתית^28,29, ותאי פסגה עצבית ב-10-30 השעות הראשונות לאחר ההפריה (HPF)³⁰, ושל תאים המטופויטיים וגידוליים בדגי זברה בוגרים ^5,31. הרחבת שיטות ההשתלה לטווח רחב של גילאים, שלבי התמיינות וסוגי תאים תשפר מאוד את כוחה של גישה זו לספק תובנות לגבי תהליכים התפתחותיים ומתחדשים.

כאן, אנו מדגימים טכניקה גמישה וחזקה להשתלת תאים ברזולוציה גבוהה יעילה בעוברים וזחלים של דגי זברה עד לפחות 7 ימים לאחר ההפריה. ניתן להשתמש בדגים פונדקאים ותורמים טרנסגניים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ברקמות המטרה כדי לחלץ תאים בודדים ולהשתיל אותם ברזולוציה מרחבית וזמנית כמעט מושלמת. הבהירות האופטית של עוברים וזחלים של דגי זברה מאפשרת לצלם את התאים המושתלים בשידור חי בזמן שהחיה המארחת מתפתחת או מתחדשת. גישה זו שימשה בעבר כדי לבחון כיצד דינמיקת איתות מרחבית-זמנית משפיעה על הזהות העצבית ועל הנחיית האקסון בעובר³², ולבחון את ההיגיון שבאמצעותו גורמים פנימיים וחיצוניים מקדמים הנחיית אקסונים במהלך התחדשות בדגי זחל³³. בעוד אנו מתמקדים כאן בהשתלת נוירונים ממוינים, השיטה שלנו ישימה באופן נרחב הן לסוגי תאים לא ממוינים והן לסוגי תאים ממוינים על פני שלבים ורקמות רבים כדי לענות על שאלות בהתפתחות והתחדשות.