Celtransplantatie met hoge resolutie bij embryonale en larvale zebravissen

Celtransplantatie heeft een lange en legendarische geschiedenis als een fundamentele techniek in de ontwikkelingsbiologie. Rond de eeuwwisseling van de 20e^eeuw veranderden benaderingen die fysieke manipulaties gebruikten om het ontwikkelingsproces te verstoren, inclusief transplantatie, de embryologie van een observationele wetenschap in een experimentele ^1,2. In een baanbrekend experiment transplanteerden Hans Spemann en Hilde Mangold ectopisch de dorsale blastopore lip van een salamanderembryo aan de andere kant van een gastheerembryo, waardoor het nabijgelegen weefsel een secundaire lichaamsas³ vormde. Dit experiment toonde aan dat cellen andere cellen ertoe konden aanzetten bepaalde lotgevallen aan te nemen, en vervolgens ontwikkelde transplantatie zich als een krachtige methode voor het ondervragen van kritische vragen in de ontwikkelingsbiologie met betrekking tot competentie en bepaling van het lot van cellen, celafstamming, inductief vermogen, plasticiteit en stamcelpotentie ^1,4,5.

Recentere wetenschappelijke ontwikkelingen hebben de kracht van de transplantatiebenadering vergroot. In 1969 maakte de ontdekking van Nicole Le Douarin dat nucleolaire kleuring soorten van oorsprong kon onderscheiden in kwartel-kuikenchimaera’s, het mogelijk om getransplanteerde cellen en hun nageslacht te volgen⁶. Dit concept werd later versterkt door de komst van transgene fluorescerende markers en geavanceerde beeldvormingstechnieken⁵, en is gebruikt om het lot van cellen te volgen ^6,7, stamcellen en hun potentie te identificeren ^8,9 en celbewegingen te volgen tijdens de ontwikkeling van de hersenen¹⁰. Bovendien vergemakkelijkte de opkomst van moleculaire genetica transplantatie tussen gastheren en donoren van verschillende genotypen, ter ondersteuning van nauwkeurige ontleding van autonome en niet-autonome functies van ontwikkelingsfactoren¹¹.

Transplantatie heeft ook een belangrijke bijdrage geleverd aan de studie van regeneratie, met name in organismen met een sterk regeneratief vermogen zoals planarians en axolotl, door de cellulaire identiteiten en interacties op te helderen die de groei en patronen van regenererende weefsels reguleren. Transplantatiestudies hebben principes van potentie¹², ruimtelijke patronen^13,14, bijdragen van specifieke weefsels^15,16 en rollen voor cellulair geheugen^12,17 bij regeneratie onthuld.

Zebravissen zijn een toonaangevend model voor gewervelde dieren voor de studie van ontwikkeling en regeneratie, ook in het zenuwstelsel, vanwege hun geconserveerde genetische programma’s, hoge genetische traceerbaarheid, externe bevruchting, grote koppelingsgrootte en optische helderheid 18,19,20. Zebravissen zijn ook zeer vatbaar voor transplantatie in vroege ontwikkelingsstadia. De meest prominente benadering is de transplantatie van cellen van een gelabeld donorembryo naar een gastheerembryo in het blastula- of gastrula-stadium om mozaïekdieren te genereren. Cellen die tijdens het blastula-stadium worden getransplanteerd, zullen zich verspreiden en verspreiden als de epiboly begint, waardoor een mozaïek van gelabelde cellen en weefsels over het embryo wordt geproduceerd²¹. Gastrula-transplantaties maken het mogelijk om getransplanteerde cellen te targeten volgens een ruwe lotkaart, aangezien het schild zich vormt en de A-P- en D-V-assen kunnen worden bepaald²¹. De resulterende mozaïeken zijn waardevol geweest bij het bepalen of genen autonoom werken, het testen van celbinding en het in kaart brengen van weefselbeweging en celmigratie tijdens de ontwikkeling ^5,11. Mozaïekzebravissen kunnen op verschillende manieren worden gegenereerd, waaronder elektroporatie²², recombinatie²³ en F0-transgenese²⁴ en mutagenese²⁵, maar transplantatie biedt de grootste manipuleerbaarheid en precisie in ruimte, tijd en aantal en soorten cellen. De huidige staat van zebravistransplantatie is grotendeels beperkt tot voorlopercellen in vroege stadia, met enkele uitzonderingen, waaronder transplantatie van spinale motorneuronen^26,27, retinale ganglioncellen^28,29 en neurale topcellen in de eerste 10-30 uur na de bevruchting (hpf)³⁰, en van hematopoëtische en tumorcellen in volwassen zebravissen ^5,31. Het uitbreiden van transplantatiemethoden naar een breed scala aan leeftijden, differentiatiestadia en celtypen zou de kracht van deze benadering om inzicht te geven in ontwikkelings- en regeneratieve processen aanzienlijk vergroten.

Hier demonstreren we een flexibele en robuuste techniek voor celtransplantatie met hoge resolutie, effectief in zebravisembryo’s en -larven tot ten minste 7 dagen na de bevruchting. Transgene gastheer- en donorvissen die fluorescerende eiwitten in doelweefsels tot expressie brengen, kunnen worden gebruikt om afzonderlijke cellen te extraheren en deze te transplanteren met een bijna perfecte ruimtelijke en temporele resolutie. De optische helderheid van zebravisembryo’s en -larven maakt het mogelijk om de getransplanteerde cellen live in beeld te brengen terwijl het gastdier zich ontwikkelt of regenereert. Deze benadering is eerder gebruikt om te onderzoeken hoe spatiotemporele signaleringsdynamiek de neuronale identiteit en axongeleiding in het embryo beïnvloedt³², en om de logica te onderzoeken waarmee intrinsieke en extrinsieke factoren axongeleiding bevorderen tijdens regeneratie in larvale vissen³³. Hoewel we ons hier richten op de transplantatie van gedifferentieerde neuronen, is onze methode breed toepasbaar op zowel ongedifferentieerde als gedifferentieerde celtypen in vele stadia en weefsels om vragen in ontwikkeling en regeneratie te beantwoorden.