Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale

Il trapianto di cellule ha una storia lunga e leggendaria come tecnica fondamentale nella biologia dello sviluppo. Intorno alla fine del XX^secolo, gli approcci che utilizzano manipolazioni fisiche per perturbare il processo di sviluppo, compreso il trapianto, hanno trasformato l’embriologia da una scienza osservativa in una sperimentale ^1,2. In un esperimento di riferimento, Hans Spemann e Hilde Mangold hanno trapiantato ectopicamente il labbro dorsale del blastopore di un embrione di salamandra sul lato opposto di un embrione ospite, inducendo il tessuto vicino a formare un asse secondario del corpo³. Questo esperimento ha dimostrato che le cellule potrebbero indurre altre cellule ad adottare determinati destini e, successivamente, il trapianto si è sviluppato come un potente metodo per interrogare questioni critiche nella biologia dello sviluppo riguardanti la competenza e la determinazione del destino cellulare, la linea cellulare, la capacità induttiva, la plasticità e la potenza delle cellule staminali ^1,4,5.

I progressi scientifici più recenti hanno ampliato la potenza dell’approccio del trapianto. Nel 1969, la scoperta di Nicole Le Douarin che la colorazione nucleolare poteva distinguere le specie di origine nelle chimere di quaglia permise di tracciare le cellule trapiantate e la loro progenie⁶. Questo concetto è stato successivamente potenziato dall’avvento dei marcatori fluorescenti transgenici e delle tecniche di imaging avanzate⁵ ed è stato sfruttato per tracciare il destino cellulare ^6,7, identificare le cellule staminali e la loro potenza ^8,9 e tracciare i movimenti cellulari durante lo sviluppo del cervello¹⁰. Inoltre, l’aumento della genetica molecolare ha facilitato il trapianto tra ospiti e donatori di genotipi distinti, supportando una precisa dissezione delle funzioni autonome e non autonome dei fattori di sviluppo¹¹.

Il trapianto ha anche dato importanti contributi allo studio della rigenerazione, in particolare in organismi con forti capacità rigenerative come le planarie e gli axolotl, chiarendo le identità cellulari e le interazioni che regolano la crescita e il pattern dei tessuti rigeneranti. Gli studi sui trapianti hanno rivelato i principi della potenza¹², del patterning spaziale^13,14, dei contributi di tessuti specifici^15,16 e dei ruoli della memoria cellulare^12,17 nella rigenerazione.

I pesci zebra sono un modello di vertebrato leader per lo studio dello sviluppo e della rigenerazione, anche nel sistema nervoso, grazie ai loro programmi genetici conservati, all’elevata trattabilità genetica, alla fecondazione esterna, alle grandi dimensioni della covata e alla chiarezza ottica 18,19,20. I pesci zebra sono anche molto suscettibili al trapianto nelle prime fasi di sviluppo. L’approccio più importante è il trapianto di cellule da un embrione di donatore marcato a un embrione ospite allo stadio di blastula o gastrula per generare animali a mosaico. Le cellule trapiantate durante la fase di blastula si disperderanno e si disperderanno all’inizio dell’epibolia, producendo un mosaico di cellule e tessuti marcati in tutto l’embrione²¹. I trapianti di gastrula consentono di indirizzare le cellule trapiantate secondo una mappa approssimativa del destino, poiché le forme dello scudo e gli assi A-P e D-V possono essere determinati²¹. I mosaici risultanti sono stati preziosi per determinare se i geni agiscono in modo autonomo nelle cellule, testando l’impegno cellulare e mappando il movimento dei tessuti e la migrazione cellulare durante lo sviluppo ^5,11. Il pesce zebra mosaico può essere generato in diversi modi, tra cui l’elettroporazione²², la ricombinazione²³ e la transgenesi F0²⁴ e la mutagenesi²⁵, ma il trapianto offre la massima manipolabilità e precisione nello spazio, nel tempo, nel numero e nei tipi di cellule. Lo stato attuale del trapianto di zebrafish è in gran parte limitato alle cellule progenitrici nelle fasi iniziali, con poche eccezioni tra cui il trapianto di motoneuroni spinali^26,27, cellule gangliari retiniche^28,29 e cellule della cresta neurale nelle prime 10-30 ore dopo la fecondazione (hpf)³⁰ e di cellule ematopoietiche e tumorali in zebrafish adulto ^5,31. L’espansione dei metodi di trapianto a un’ampia gamma di età, stadi di differenziazione e tipi di cellule aumenterebbe notevolmente la potenza di questo approccio nel fornire informazioni sui processi di sviluppo e rigenerativi.

Qui, dimostriamo una tecnica flessibile e robusta per il trapianto di cellule ad alta risoluzione efficace in embrioni e larve di zebrafish fino ad almeno 7 giorni dopo la fecondazione. I pesci ospiti e donatori transgenici che esprimono proteine fluorescenti nei tessuti bersaglio possono essere utilizzati per estrarre singole cellule e trapiantarle con una risoluzione spaziale e temporale quasi perfetta. La chiarezza ottica degli embrioni e delle larve di zebrafish consente di visualizzare le cellule trapiantate dal vivo mentre l’animale ospite si sviluppa o si rigenera. Questo approccio è stato precedentemente utilizzato per esaminare come le dinamiche di segnalazione spazio-temporale influenzino l’identità neuronale e la guida degli assoni nell’embrione³² e per esaminare la logica con cui i fattori intrinseci ed estrinseci promuovono la guida degli assoni durante la rigenerazione nei pesci larvali³³. Mentre ci concentriamo qui sul trapianto di neuroni differenziati, il nostro metodo è ampiamente applicabile sia a tipi di cellule indifferenziate che differenziate in molti stadi e tessuti per affrontare le questioni relative allo sviluppo e alla rigenerazione.