ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

細胞移植は、発生生物学の基礎技術として長い歴史を持っています。20^世紀初頭頃、移植を含む発生過程を物理的に操作するアプローチにより、発生学は観察科学から実験科学へと変貌を遂げた^1,2。ある画期的な実験では、ハンス・シュペーマンとヒルデ・マンゴールドが、サンショウウオ胚の背側胚盤胞唇を宿主胚の反対側に異所性移植し、近くの組織に二次^{体軸を形成する}ように誘導した3。この実験により、細胞が他の細胞を特定運命に誘導できることが示され、その後、移植は、能力と細胞運命決定、細胞系譜、誘導能力、可塑性、および幹細胞の^{効力に関する}発生生物学の重要な問題を問うための強力な方法として開発されました^1,4,5。

最近の科学の進歩により、移植アプローチの力が拡大しています。1969年、Nicole Le Douarinが核小体染色によりウズラ-ヒヨドリキメラの起源種を区別できるという発見により、移植された細胞とその子孫の追跡が可能になりました⁶。この概念は、後にトランスジェニック蛍光マーカーと高度なイメージング技術⁵の出現によって加速され、細胞運命の追跡^6,7、幹細胞とその効力の同定^8,9、および脳発生中の細胞運動の追跡¹⁰に活用されました。さらに、分子遺伝学の台頭は、異なる遺伝子型の宿主とドナーとの間の移植を促進し、発生因子の自律的および非自律的な機能の正確な解剖を支持した¹¹。

移植はまた、再生組織の成長とパターン形成を調節する細胞の同一性と相互作用を解明することにより、特にプラナリアやウーパールーパーなどの強力な再生能力を持つ生物の再生の研究にも重要な貢献をしてきました。移植研究により、効力¹²、空間パターン^化13,14、特定の組織の寄与^15,16、および再生における細胞記憶^12,17の役割の原理が明らかになった。

ゼブラフィッシュは、保存された遺伝的プログラム、高い遺伝的扱いやすさ、体外受精、大きなクラッチサイズ、および光学的透明度18,19,20により、神経系を含む発生と再生の研究のための主要な脊椎動物モデルです。また、ゼブラフィッシュは発生初期に移植するのに非常に適しています。最も顕著なアプローチは、標識されたドナー胚から胞胚または原腸の段階で宿主胚に細胞を移植してモザイク動物を生成することです。胞胚期に移植された細胞は、エピボリーが始まると散乱して分散し、胚²¹全体に標識された細胞と組織のモザイクを生成する。胃腸移植は、シールドが形成され、A-P軸とD-V軸が決定される²¹として、大まかな運命マップに従って移植された細胞のいくつかの標的化を可能にする。得られたモザイクは、遺伝子が細胞に自律的に作用するかどうかの判断、細胞の関与の試験、および発生全体にわたる組織の動きと細胞移動のマッピングに役立っています^5,11。モザイクゼブラフィッシュは、エレクトロポレーション²²、組換え²³、F0トランスジェネシス²⁴、突然変異誘発²⁵など、いくつかの方法で作製することができるが、移植は、空間、時間、細胞の数と種類において最大の操作性と精度を提供する。ゼブラフィッシュ移植の現状は、脊髄運動ニューロン^26,27、網膜神経節細胞^28,29、受精後10-30時間以内の神経堤細胞(HPF)³⁰、成体ゼ^{ブラフィッシュ}の造血細胞および腫瘍細胞^5,31などの例外を除いて、初期段階では主に前駆細胞に限られている.移植法を幅広い年齢、分化段階、細胞型に拡大することで、このアプローチの力が大幅に向上し、発生および再生プロセスに関する洞察が得られるでしょう。

ここでは、ゼブラフィッシュの胚と幼虫に受精後少なくとも7日まで有効な高解像度細胞移植のための柔軟で堅牢な技術を実証します。標的組織に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック宿主およびドナーフィッシュを使用して、単一細胞を抽出し、ほぼ完璧な空間的および時間的分解能で移植することができます。ゼブラフィッシュの胚と幼生の光学的透明度により、宿主動物が発育または再生する間、移植された細胞を生きたまま画像化することができます。このアプローチは、時空間的なシグナル伝達ダイナミクスが胚³²のニューロンの同一性と軸索の誘導にどのように影響するかを調べ、内因性および外因性の因子が幼魚の再生中に軸索の誘導を促進するロジックを調べるために以前に使用されてきました³³。ここでは分化したニューロンの移植に焦点を当てていますが、私たちの方法は、発生と再生の問題に対処するために、多くの段階や組織にわたって未分化細胞タイプと分化細胞タイプの両方に広く適用できます。