Трансплантация клеток высокого разрешения у эмбрионов и личинок рыбок данио рерио

Трансплантация клеток имеет долгую и легендарную историю как основополагающий метод в биологии развития. На рубеже^20-го века подходы с использованием физических манипуляций для нарушения процесса развития, включая трансплантацию, превратили эмбриологию из наблюдательной науки в^{экспериментальную.} В одном из знаковых экспериментов Ганс Шпеман и Хильде Мангольд эктопически пересадили дорсальную бластопорную губу эмбриона саламандры на противоположную сторону эмбриона-хозяина, заставив близлежащую ткань сформировать вторичную^{ось тела}. Этот эксперимент показал, что клетки могут побуждать другие клетки принимать определенную судьбу, и впоследствии трансплантация стала мощным методом для изучения критических вопросов в биологии развития, касающихся компетентности и определения судьбы клетки, клеточной линии, индуктивной способности, пластичности и активности стволовых ^{клеток.}

Более поздние научные достижения расширили возможности трансплантационного подхода. В 1969 году открытие Николь Ле Дуарен о том, что ядрышковое окрашивание может различать виды происхождения у химер перепелов и птенцов, позволило отслеживать трансплантированные клетки и их потомство^. Эта концепция была позже усилена появлением трансгенных флуоресцентных маркеров и^{передовых методов} визуализации5 и была использована для отслеживания судьбы клеток ^6,7, идентификации стволовых клеток и их активности ^8,9 и отслеживания движений клеток во время развития мозга¹⁰. Кроме того, развитие молекулярной генетики облегчило трансплантацию между хозяевами и донорами различных генотипов, способствуя точному препарированию автономных и неавтономных^{функций факторов развития}.

Трансплантация также внесла важный вклад в изучение регенерации, особенно у организмов с сильными регенеративными способностями, таких как планарии и аксолотли, прояснив клеточную идентичность и взаимодействия, которые регулируют рост и структуру регенерирующих тканей. Исследования трансплантации выявили принципы потенции¹², пространственного паттернинга^13,14, вклада конкретных тканей^15,16 и роли клеточной памяти^12,17 в регенерации.

Рыбки данио являются ведущей моделью позвоночных для изучения развития и регенерации, в том числе в нервной системе, благодаря их консервативным генетическим программам, высокой генетической управляемости, внешнему оплодотворению, большому размеру кладки и оптической прозрачности 18,19,20. Рыбки данио также хорошо поддаются трансплантации на ранних стадиях развития. Наиболее распространенным подходом является трансплантация клеток от меченого донорского эмбриона к эмбриону-хозяину на стадии бластулы или гаструлы для получения мозаичных животных. Клетки, трансплантированные на стадии бластулы, будут рассеиваться и рассеиваться в начале эпиболии, создавая мозаику меченых клеток и тканей по всему эмбриону²¹. Трансплантаты гаструл позволяют в некоторой степени нацеливаться на трансплантированные клетки в соответствии с приблизительной картой судьбы по мере формирования щита и определения осей A-P и D-V²¹. Полученные мозаики оказались полезными для определения того, действуют ли гены в клетке автономно, проверки приверженности клеток и картирования движения тканей и миграции клеток на протяжении всего развития ^5,11. Мозаичные рыбки данио рерио могут быть получены несколькими способами, включая электропорацию²², рекомбинацию²³, а также трансгенез F0²⁴ и мутагенез²⁵, но трансплантация обеспечивает наибольшую манипулируемость и точность в пространстве, времени, количестве и типах клеток. Современное состояние трансплантации рыбок данио в значительной степени ограничено клетками-предшественниками на ранних стадиях, за некоторыми исключениями, включая трансплантацию спинальных моторных нейронов^26,27, ганглиозных клеток сетчатки^28,29 и клеток нервного гребня в первые 10-30 ч после оплодотворения (ВПФ)³⁰, а также гемопоэтических и опухолевых клеток у взрослых рыбок данио-рерио ^5,31. Распространение методов трансплантации на широкий диапазон возрастов, стадий дифференцировки и типов клеток значительно усилит возможности этого подхода для понимания процессов развития и регенерации.

В этой статье мы демонстрируем гибкую и надежную технику трансплантации клеток с высоким разрешением, эффективную для эмбрионов и личинок рыбок данио-рерио в течение как минимум 7 дней после оплодотворения. Трансгенные рыбы-хозяева и доноры, экспрессирующие флуоресцентные белки в тканях-мишенях, могут быть использованы для извлечения одиночных клеток и их трансплантации с почти идеальным пространственным и временным разрешением. Оптическая прозрачность эмбрионов и личинок рыбок данио позволяет визуализировать трансплантированные клетки вживую по мере развития или регенерации животного-хозяина. Этот подход ранее использовался для изучения того, как пространственно-временная сигнальная динамика влияет на идентичность нейронов и направление аксонов у эмбриона³², а также для изучения логики, с помощью которой внутренние и внешние факторы способствуют управлению аксонами во время регенерации у личиночных рыб³³. Несмотря на то, что мы сосредоточились здесь на трансплантации дифференцированных нейронов, наш метод широко применим как к недифференцированным, так и к дифференцированным типам клеток на многих стадиях и тканях для решения вопросов развития и регенерации.