Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Die Zelltransplantation hat eine lange und geschichtsträchtige Geschichte als grundlegende Technik in der Entwicklungsbiologie. Um die Wende zum 20^{. Jahrhundert verwandelten} Ansätze, die physikalische Manipulationen zur Störung des Entwicklungsprozesses, einschließlich der Transplantation, nutzten, um die Embryologie von einer beobachtenden Wissenschaft in eine experimentelle Wissenschaft ^1,2. In einem bahnbrechenden Experiment transplantierten Hans Spemann und Hilde Mangold ektopisch die dorsale blastopore Lippe eines Salamanderembryos auf die gegenüberliegende Seite eines Wirtsembryos, wodurch das nahe gelegene Gewebe dazu gebracht wurde, eine sekundäre Körperachse³ zu bilden. Dieses Experiment zeigte, dass Zellen andere Zellen dazu bringen können, bestimmte Schicksale anzunehmen, und in der Folge entwickelte sich die Transplantation als leistungsfähige Methode, um kritische Fragen in der Entwicklungsbiologie in Bezug auf Kompetenz und Zellschicksalsbestimmung, Zellabstammung, induktive Fähigkeit, Plastizität und Stammzellpotenz zu hinterfragen ^1,4,5.

Neuere wissenschaftliche Fortschritte haben die Leistungsfähigkeit des Transplantationsansatzes erweitert. Im Jahr 1969 ermöglichte Nicole Le Douarins Entdeckung, dass die nukleoläre Färbung Ursprungsarten in Wachtel-Küken-Chimären unterscheiden kann, die Verfolgung transplantierter Zellen und ihrer Nachkommen⁶. Dieses Konzept wurde später durch das Aufkommen transgener Fluoreszenzmarker und fortschrittlicher bildgebender Verfahren verstärkt⁵ und wurde genutzt, um das Zellschicksal zu verfolgen ^6,7, Stammzellen und ihre Potenz zu identifizieren ^8,9 und Zellbewegungen während der Gehirnentwicklung^{zu verfolgen 10}. Darüber hinaus erleichterte das Aufkommen der Molekulargenetik die Transplantation zwischen Wirten und Spendern unterschiedlicher Genotypen und unterstützte die präzise Aufschlüsselung autonomer und nicht-autonomer Funktionen von Entwicklungsfaktoren¹¹.

Die Transplantation hat auch einen wichtigen Beitrag zur Erforschung der Regeneration geleistet, insbesondere bei Organismen mit starken regenerativen Fähigkeiten wie Planarien und Axolotln, indem sie die zellulären Identitäten und Wechselwirkungen aufklärte, die das Wachstum und die Musterbildung von regenerierendem Gewebe regulieren. Transplantationsstudien haben Prinzipien der Potenz¹², der räumlichen Musterbildung^13,14, der Beiträge spezifischer Gewebe^15,16 und der Rolle des zellulären Gedächtnisses^12,17 bei der Regeneration aufgedeckt.

Zebrafische sind aufgrund ihrer konservierten genetischen Programme, ihrer hohen genetischen Rückverfolgbarkeit, ihrer externen Befruchtung, ihrer großen Gelegegröße und ihrer optischen Klarheit ein führendes Wirbeltiermodell für die Erforschung von Entwicklung und Regeneration, einschließlich des Nervensystems. Zebrafische sind auch sehr gut für eine Transplantation in frühen Entwicklungsstadien geeignet. Der bekannteste Ansatz ist die Transplantation von Zellen von einem markierten Spenderembryo auf einen Wirtsembryo im Blastula- oder Gastrula-Stadium, um Mosaiktiere zu erzeugen. Zellen, die während des Blastula-Stadiums transplantiert werden, zerstreuen und zerstreuen sich, wenn die Epibolie beginnt, wodurch ein Mosaik aus markierten Zellen und Geweben über den Embryo entsteht²¹. Gastroula-Transplantationen ermöglichen ein gewisses Targeting von transplantierten Zellen gemäß einer groben Schicksalskarte, da die Schildformen und die A-P- und D-V-Achsen bestimmt werden können²¹. Die daraus resultierenden Mosaike waren wertvoll bei der Bestimmung, ob Gene zellautonom handeln, bei der Untersuchung des Zellengagements und bei der Kartierung von Gewebebewegungen und Zellmigration während der gesamten Entwicklung ^5,11. Mosaik-Zebrafische können auf verschiedene Weise erzeugt werden, einschließlich Elektroporation²², Rekombination²³ und F0-Transgenese²⁴ und Mutagenese²⁵, aber die Transplantation bietet die größte Manipulierbarkeit und Präzision in Bezug auf Raum, Zeit, Anzahl und Art der Zellen. Der derzeitige Stand der Zebrafischtransplantation ist weitgehend auf Vorläuferzellen in frühen Stadien beschränkt, mit wenigen Ausnahmen wie der Transplantation von spinalen Motoneuronen ^26,27, retinalen Ganglienzellen^28,29 und Neuralleistenzellen in den ersten 10-30 Stunden nach der Befruchtung (hpf)³⁰ und von hämatopoetischen und Tumorzellen bei adulten Zebrafischen ^5,31. Die Ausweitung der Transplantationsmethoden auf ein breites Spektrum von Altersgruppen, Differenzierungsstadien und Zelltypen würde die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes, Einblicke in Entwicklungs- und Regenerationsprozesse zu gewinnen, erheblich verbessern.

Hier demonstrieren wir eine flexible und robuste Technik für die hochauflösende Zelltransplantation, die bei Zebrafischembryonen und -larven bis zu mindestens 7 Tage nach der Befruchtung wirksam ist. Transgene Wirts- und Spenderfische, die fluoreszierende Proteine in Zielgeweben exprimieren, können verwendet werden, um einzelne Zellen zu extrahieren und sie mit nahezu perfekter räumlicher und zeitlicher Auflösung zu transplantieren. Die optische Klarheit von Zebrafischembryonen und -larven ermöglicht es, die transplantierten Zellen live abzubilden, während sich das Wirtstier entwickelt oder regeneriert. Dieser Ansatz wurde bereits verwendet, um zu untersuchen, wie die raumzeitliche Signaldynamik die neuronale Identität und die Axonführung im Embryo^{beeinflusst 32}, und um die Logik zu untersuchen, nach der intrinsische und extrinsische Faktoren die Axonführung während der Regeneration bei Fischlarven fördern³³. Während wir uns hier auf die Transplantation differenzierter Neuronen konzentrieren, ist unsere Methode sowohl auf undifferenzierte als auch auf differenzierte Zelltypen über viele Stadien und Gewebe hinweg anwendbar, um Fragen der Entwicklung und Regeneration zu beantworten.