Imaging in vivo del calcio delle cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo nei topi

Studi precedenti hanno scoperto che l’ippocampo è una struttura cerebrale essenziale per l’elaborazione e il recupero dei ricordi ^1,2. Dagli anni ’50, i circuiti neurali dell’ippocampo nei roditori sono stati al centro dello studio della formazione, dell’archiviazione e del recupero della memoria³. Le strutture anatomiche all’interno dell’ippocampo includono le sottoregioni del giro dentato (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 e il subiculum⁴. Esistono complesse connessioni bidirezionali tra queste sottoregioni, di cui DG, CA1 e CA3 formano un circuito trisinaptico prominente costituito da cellule granulari e cellule piramidali⁵. Questo circuito riceve il suo input primario dalla corteccia entorinale (EC) ed è stato un modello classico per lo studio della plasticità sinaptica. Precedenti ricerche in vivo sulla funzione dell’ippocampo si sono concentrate principalmente sul CA1 ^6,7 a causa del suo più facile accesso. Mentre i neuroni CA1 svolgono un ruolo importante nella formazione, nel consolidamento e nel recupero della memoria, in particolare nelle cellule di posizione per la memoria spaziale, anche altre sottoregioni dell’ippocampo sono vitali ^8,9. In particolare, recenti studi hanno evidenziato le funzioni della DG nella formazione della memoria. È stato riportato che le cellule di posizione in DG sono più stabili di quelle in CA1¹⁰ e le loro attività riflettono informazioni specifiche del contesto¹¹. Inoltre, la marcatura dipendente dall’attività delle cellule granulari DG può essere riattivata per indurre comportamenti correlati alla memoria¹². Pertanto, per ottenere una comprensione più profonda della codifica delle informazioni in DG, è fondamentale studiare le attività della sottoregione DG mentre l’animale svolge compiti dipendenti dalla memoria.

Studi precedenti sulle attività della DG hanno utilizzato principalmente l’elettrofisiologia in vivo ¹³. Tuttavia, questa tecnica presenta alcuni inconvenienti: in primo luogo, nelle registrazioni elettriche, può essere difficile identificare direttamente i vari tipi di cellule che generano il segnale. I segnali registrati provengono sia da cellule inibitorie che eccitatorie. Pertanto, sono necessari ulteriori metodi di elaborazione dei dati per separare questi due tipi di celle. Inoltre, è difficile combinare altre informazioni sul tipo di cellula, come i sottogruppi specifici della proiezione o l’etichettatura dipendente dall’attività, con le registrazioni elettriche. Inoltre, a causa della morfologia anatomica del DG, gli elettrodi di registrazione sono spesso impiantati in una direzione ortogonale, il che limita notevolmente il numero di neuroni che possono essere registrati. Pertanto, è difficile per le registrazioni elettriche ottenere il monitoraggio di centinaia di singoli neuroni dalla struttura DG nello stesso animale¹⁴.

Una tecnica complementare di registrazione delle attività dei neuroni in DG consiste nell’utilizzare l’imaging del calcio in vivo ¹⁵. Gli ioni calcio sono fondamentali per i processi di segnalazione cellulare negli organismi, svolgendo un ruolo cruciale in molte funzioni fisiologiche, soprattutto all’interno del sistema nervoso dei mammiferi. Quando i neuroni sono attivi, la concentrazione intracellulare di calcio aumenta rapidamente, riflettendo la natura dinamica dell’attività neuronale e della trasmissione del segnale. Pertanto, la registrazione in tempo reale dei cambiamenti nei livelli intracellulari di calcio nei neuroni fornisce importanti informazioni sui meccanismi di codifica neurale.

La tecnologia di imaging del calcio utilizza coloranti fluorescenti specializzati o indicatori di calcio geneticamente modificati (GECI) per monitorare le concentrazioni di ioni calcio nei neuroni rilevando i cambiamenti nell’intensità della fluorescenza, che possono quindi essere catturati attraverso l’imaging microscopico¹⁶. Comunemente, viene impiegata la famiglia GCaMP di geni indicatori del calcio, che comprende la proteina fluorescente verde (GFP), la calmodulina e le sequenze polipeptidiche M13. GCaMP può emettere fluorescenza verde quando si lega agli ioni calcio¹⁷, consentendo di registrare le fluttuazioni della fluorescenza verde tramite imaging¹⁸. Inoltre, per ottenere immagini chiare della regione del cervello bersaglio, una lente con indice di gradiente (lente GRIN) viene tipicamente impiantata sopra la regione di interesse. La lente GRIN consente l’imaging della regione profonda del cervello a cui non è possibile accedere direttamente dalla superficie.

Questa tecnica è relativamente facile da combinare con altri strumenti genetici per marcare diversi tipi di cellule. Inoltre, poiché il piano di imaging è parallelo all’orientamento delle cellule in DG, centinaia di neuroni sono accessibili per l’imaging con ogni intervento chirurgico riuscito. In questo lavoro, presentiamo un protocollo chirurgico completo e dettagliato per l’imaging in vivo del calcio nel giro dentato nei topi (Figura 1). La procedura prevede due operazioni principali. Il primo è quello di iniettare il virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f nel DG. La seconda operazione consiste nell’impiantare una lente GRIN sopra il sito di iniezione del virus. Queste due procedure vengono eseguite nella stessa seduta. Dopo il recupero da questi interventi chirurgici, il passo successivo è quello di controllare la qualità dell’imaging con microscopi miniaturizzati (miniscopi). Se il campo di imaging ha centinaia di cellule attive, la procedura successiva consiste nel fissare la piastra di base del miniscopio al cranio del topo utilizzando cemento dentale; Il mouse può quindi essere utilizzato per esperimenti di imaging. Presentiamo anche una pipeline di pre-elaborazione basata su MATLAB per semplificare l’analisi dei dati raccolti sul calcio.