概要

マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング

Published: August 02, 2024
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概要

海馬の歯状回は、学習と記憶において重要で明確な機能を果たします。このプロトコルは、自由に動くマウスの歯状回における顆粒細胞の in vivo カルシウムイメージングのための一連の堅牢で効率的な手順を説明しています。

Abstract

学習と記憶の研究には通常、リアルタイムのアプローチが必要であり、 in vivo カルシウムイメージングは、行動課題中の覚醒動物のニューロン活動を調査する可能性を提供します。海馬はエピソード記憶や空間記憶と密接に関連しているため、この分野の研究において重要な脳領域となっています。近年の研究では、海馬CA1領域の神経活動を小型顕微鏡を用いて記録し、マウスを用いてオープンフィールドやリニアトラックなどの行動課題を行いながら、エングラム細胞や場所細胞を研究しています。歯状回は海馬のもう一つの重要な領域ですが、その深さが深く、イメージングが難しいため、 in vivo イメージングで研究されることはほとんどありませんでした。このプロトコルでは、ウイルスの注入方法、GRIN(Gradient-index)レンズの埋め込み方法、海馬の歯状回をイメージングするためのベースプレートの取り付け方法など、カルシウムイメージングプロセスを詳細に提示します。さらに、MATLAB を使用してカルシウムイメージング データを前処理する方法についても説明します。さらに、イメージングが必要な他の脳深部領域の研究も、この方法の恩恵を受ける可能性があります。

Introduction

これまでの研究では、海馬は記憶の処理や想起に不可欠な脳の構造であることがわかっています1,2。1950年代以降、げっ歯類の海馬の神経回路は、記憶の形成、保存、および検索の研究において焦点となってきました3。海馬内の解剖学的構造には、歯状回(DG)、CA1、CA2、CA3、CA4、およびsubiculum4の亜領域が含まれます。これらのサブリージョン間には複雑な双方向の接続が存在し、そのうちDG、CA1、およびCA3は、顆粒細胞と錐体細胞5からなる顕著な三シナプス回路を形成しています。この回路は、嗅内皮質(EC)から主要な入力を受け取り、シナプスの可塑性を研究するための古典的なモデルとなっています。海馬機能に関する以前のin vivo研究は、そのアクセスの容易さから、主にCA1 6,7に集中していました。CA1ニューロンは、記憶の形成、固定、および検索において重要な役割を果たしますが、特に空間記憶のための細胞では、海馬の他のサブ領域も重要です8,9。特に、最近の研究では、記憶形成におけるDGの機能が注目されています。DGの場所細胞はCA110の場所細胞よりも安定していることが報告されており、その活動は状況特異的な情報を反映している11。さらに、DG顆粒細胞の活性依存的な標識は、記憶関連の行動を誘導するために再活性化することができる12。したがって、DGの情報コーディングをより深く理解するためには、動物が記憶依存的なタスクを実行している間のDG亜領域の活動を調査することが重要です。

DG活性に関する先行研究では、主に in vivo 電気生理学13が用いられてきた。しかし、この手法にはいくつかの欠点があります:まず、電気記録では、シグナルを生成しているさまざまな種類の細胞を直接特定することが難しい場合があります。記録されたシグナルは、抑制性細胞と興奮性細胞の両方からのものです。したがって、これら2つの細胞タイプを分離するためには、さらなるデータ処理方法が必要となる。さらに、プロジェクション特異的なサブグループや活性依存的な標識など、他の細胞型情報を電気記録と組み合わせることは困難です。さらに、DGの解剖学的形態により、記録電極は直交方向に埋め込まれることが多く、記録できるニューロンの数が大幅に制限されます。したがって、電気記録が同一動物14のDG構造から数百の個々のニューロンをモニタリングすることは困難である。

DGにおけるニューロン活動を記録する補完的な技術は、 in vivo カルシウムイメージング15を使用することである。カルシウムイオンは、生物の細胞シグナル伝達プロセスの基本であり、特に哺乳類の神経系における多くの生理学的機能において重要な役割を果たしています。ニューロンが活動しているとき、細胞内のカルシウム濃度は急速に増加し、これはニューロンの活動とシグナル伝達の動的な性質を反映しています。したがって、ニューロンの細胞内カルシウムレベルのリアルタイムな変化を記録することは、神経コードメカニズムに関する重要な洞察を提供します。

カルシウムイメージング技術は、特殊な蛍光色素または遺伝子組み換えカルシウムインジケーター(GECI)を利用して、蛍光強度の変化を検出することによりニューロン内のカルシウムイオン濃度をモニターし、それを顕微鏡イメージング16で捉えることができる。一般に、緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン、およびM13ポリペプチド配列を含むカルシウム指標遺伝子のGCaMPファミリーが採用されます。GCaMPは、カルシウムイオン17に結合すると緑色蛍光を発することができ、緑色蛍光の変動をイメージング18を通じて記録することができる。さらに、標的の脳領域の鮮明な画像を得るために、通常、グラディエントインデックスレンズ(GRINレンズ)を関心領域の上に埋め込む。GRINレンズは、表面から直接アクセスできない脳深部領域のイメージングを可能にします。

この手法は、他の遺伝ツールと組み合わせて、さまざまな細胞タイプを標識するのに比較的簡単です。さらに、イメージング面はDGの細胞の向きと平行であるため、手術が成功するたびに数百のニューロンがイメージングに利用できます。この研究では、マウスの歯状回における in vivo カルシウムイメージングのための完全で詳細な手術プロトコルを紹介します(図1)。この手順には、2つの主要な操作が含まれます。1つ目は、AAV-CaMKIIα-GCaMP6fウイルスをDGに注入することです。2つ目の手術は、ウイルス注入部位の上にGRINレンズを埋め込むことです。これら2つの手順は、同じ座り方で行われます。これらの手術から回復した後、次のステップは、小型顕微鏡(ミニスコープ)でイメージング品質を確認することです。イメージングフィールドに数百の活性細胞がある場合、その後の手順は、歯科用セメントを使用してミニスコープベースプレートをマウスの頭蓋骨に取り付けることです。その後、マウスをイメージング実験に使用できます。また、収集されたカルシウムデータの解析を効率化するためのMATLABベースの前処理パイプラインについても紹介します。

Protocol

すべての動物手続きは、復旦大学の動物管理および使用委員会(202109004S)によって承認されました。この研究で使用されたすべての動物は、生後6か月のC57BL / 6Jでした。男女ともに使用しました。マウスを午前8時から午後8時まで12時間の光サイクルで飼育しました。脳表面からDG:A/P:-2.2mm、M/L:1.5mm、D/V:1.7mmの座標でウイルス注入を行いました。 1.歯状回へのウイルス注入 使い捨ての滅菌手袋やガウンなどの保護具を着用してください。 必要な手術器具、5 mL の生理食塩水 (0.9% NaCl [滅菌] または人工脳脊髄液) のチューブ 2 本、および 25 G ルアーロック鈍針 2 本を準備します。注:すべての手術器具は、手術前に徹底的に滅菌する必要があります。高温(121-134°C)と高圧(20psi)でのオートクレーブを使用して、手術器具を滅菌しました。さらに、アルコールベースの消毒液を表面にスプレーしました。すべての外科的処置において、0.9%滅菌生理食塩水を使用しました。手術中に器具を加熱したガラスビーズで断続的に滅菌しました。 ウイルスと接触する可能性のある消耗品を消毒するために、水に10%漂白剤溶液を準備します。 必要に応じて、滅菌した生理食塩水を使用してAAV-CaMKIIα-GCaMP6fウイルスを希釈し、4°Cの冷蔵庫または氷上で保存します。ウイルスの目標最終力価は1 × 1012 GC/mLです。注:ウイルスの完全性を維持するために、ウイルスの凍結融解サイクルを繰り返さないようにすることをお勧めします。この目的のために、通常、メーカーから受け取ったウイルスを少量(チューブあたり2μLなど)に分注し、-80°Cの冷凍庫で保管します。ウイルスは解凍日に使用し、長期間使用するために4°Cで保存しないでください。 マイクロピペットプーラーを使用してマイクロピペットを細い先端に引っ張り、手術用ハサミで先端の一部を切り取り、チューブにミネラルオイルを充填します。ピペットが正常に液体を吸うことができることを確認してから、インジェクターに取り付けます。注:ヒーターを最大出力の~60%に設定したワンステッププル方式を使用しました。このステップには、他のプーラーを使用できます。全体的な目標は、先端の直径を 50 ~ 100 μm にすることです。直径が小さすぎると、液体の流れに影響します。厚すぎると、マウスの脳組織に損傷を与える可能性があります。 マウス麻酔器、温度維持装置(加熱パッド)、真空ポンプを含むすべての器具の電源を入れます。また、手術前にマウスの体重を測定します。注:手術中、マウスの呼吸を視覚的に監視し、時々体温をチェックして、マウスの状態が良好であることを確認しました。 マウスを2.5%イソフルランと1Lの酸素/分を入れたガスチャンバーに入れます。マウスの呼吸状態を監視して、麻酔の状態を測定します。注:マウスを健康に保つために、呼吸数は約1呼吸/秒である必要があります。 マウスをガス室から取り出し、定位固定装置の上に置く。 次の操作を開始する前に、マウスが適切に麻酔されていることを確認してください。両後足のフットパッドをつまんで、ペダルの離脱反射をテストします。マウスがフットパッドのピンチに反応した場合は、追加の麻酔を投与し、先に進む前に反射を再テストします。 マウスの鼻をマスクで覆い、イソフルランの流量を1.5%に設定します。マウスヘッドをイヤーバーでしっかりと固定します(図2A)。注意: イヤーバーをマウスにきつく固定しすぎると、マウスの呼吸に影響を及ぼしやすく、場合によっては死に至る可能性があるため、注意してください。 手術用ハサミでマウスの頭のてっぺんを切り取り、脱毛クリームを使用して、皮膚が完全に露出するまで残った毛を取り除きます。脱毛クリームをマウスの頭皮に塗布し、約5分間放置し、ガーゼでクリームを拭き取ります。 マウスの目に眼科用軟膏を塗ります。 綿棒を使用して、ヨードフォア消毒剤と75%エタノールで無毛の部分を消毒します。 手術用ハサミ(またはメスの刃)を使用して頭皮の正中線に沿って連続的に切開し、頭皮の一部を切り取って頭蓋骨の表面を露出させます(図2B)。頭蓋骨の表面を生理食塩水ですすいでください。次に、真空ポンプを使用して筋膜と過剰な生理食塩水を取り除きます。創傷の周りの出血が止まるまで、このプロセスを複数回繰り返します。頭蓋骨の表面を綿棒で拭いて、乾いた状態に保ちます。注意: 筋膜を取り外すには、コットンボールや綿棒で鼻隠しを拭くなど、他の方法があります。 位置決め針を使用して、ブレグマとラムダが見えるときに頭蓋表面を調整します。ヘッド全体が水平になるまで、いくつかの調整を行います(Z軸方向の全体の誤差は0.05mm未満です)。 針の先端をブレグマから適切な目標位置に移動します。ターゲット座標には、参照点として bregma を使用します。ウイルス注入部位の周囲を定義するために4つのポイントをマークします:A / P:-2.0 mm、M / L:-1.5 mm;A / P:-2.5 mm、M / L:-1.5 mm;A / P -2.25 mm、M / L:-1.0 mm;A/P -2.25 mm、M/L: -2.0 mm、消去可能なマーカー付き。注:このプロトコルは、ウイルス注射とGRINレンズの埋め込みを同じ手術で行います。このプロトコルでは、すべての手術は右半球で行われましたが、どちらの半球も使用できると考えられます。上記の4つのポイントで定義された注射領域内で、ウイルスを別々の場所に3回に分けて80nLの用量で注射します。3つの場所は任意に選択されていますが、ウイルスの拡散を改善するために、それらを分散させることをお勧めします。これにより、感染した細胞の数が増えます。 マイクロドリルでその領域に開頭術を行い、これらの4つのポイントを境界線として設定します。脳組織が見えたら、穴あけを停止します(図2C)。注:頭蓋骨をゆっくりとドリルしてみてください。ドリルビットは、過度の力により脳組織に害を及ぼす可能性があります。ゆっくりと穴を開けることで、脳の過熱を防ぐこともできます。 超微細鉗子を使用して骨の破片と硬膜を取り除き、この領域を滅菌生理食塩水で常にすすぎます。注:このステップでは、一部の毛細血管が破裂するため、少量の出血が発生するのは正常です。出血がなくなるまで生理食塩水ですすいでください。 インジェクターのコントロールパネルを使用して鉱油を排出し、その後のウイルスのロードに必要なスペースを生成します。希釈したウイルスを少なくとも240nLでマイクロピペットに100 nL/sの速度で充填します。注意: チューブ内の気泡は、マイクロピペットが適切な量の液体を分注することを保証するために、コントロールパネルを使用して排出する必要があります。何度も試しても液量が不正確な場合は、マイクロピペットを交換して最初からやり直すことを検討してください。実際の注入量よりも追加のウイルスを吸引することをお勧めします。このアプローチにより、マウスの脳に鉱物油が誤って注入されるのを防ぐことができます。 マイクロピペットを開頭術領域の上に移動します。次に、それをゆっくりと脳組織に下ろし、D / Vの目標Z軸(脳表面から1.70 mm下)に移動します。注:多くの参照アトラスは、頭蓋骨の表面をD / V 0として使用しています。私たちの経験では、脳表面の座標を使用することで、DGのターゲティングの信頼性が向上しました。 コントロールパネルを使用して、1 nL/sの流量で80 nLのウイルスを注入するようにインジェクターを設定します(図2D)。コントロールパネルの [INJECT ]ボタンをクリックして、ウイルスを注入します。その後、開頭術内の他の2つの位置を選択し、前の操作を繰り返します。注:各注射には~2分かかります。注射が終了したら、さらに8〜10分待ってから別の位置に移動します。除去中に出血が発生した場合は、速やかに生理食塩水で洗ってください。 マイクロピペットを脳からゆっくりと取り出します(図2E)。 2. 歯状回へのGRINレンズ移植 注:この手順は、240 nLウイルス注入を完了した直後に実行してください。 直径1mmのGRINレンズを75%エタノールで20分間消毒します。移植前に生理食塩水で適切にすすいでください。 マイクロドリルを使用して開頭術を拡大し、A / P方向の開口部を約1mmに増やします。生理食塩水で破片を取り除きます。 clamp GRINレンズをホルダーで所定の位置に固定し、適切な長さを露出させることを確認してください。注:ホルダーをGRINレンズに接着するのは、後続の手順でUV樹脂を使用して頭蓋骨に固定するときです。ただし、レンズの露光時間が適切であれば、これを回避できます。 ホルダーを使用して、GRINレンズを開頭領域の上に移動します。GRINレンズの底面が脳組織の表面に触れるとき、Z軸の位置をゼロにします。次に、GRINレンズホルダーを取り外して脇に置きます。 真空ポンプ吸引管に25Gルアーロック鈍針を取り付け、圧力を0.04MPaに調整します。注:この手順を初めて実行する場合は、圧力を適切に下げて脳組織をゆっくりと吸引することができます。 鈍い針の先端を脳組織の真上に回転させて脳組織を吸引し、脳組織を優しく押して吸引を促進します。吸引中は生理食塩水ですすいで(4°Cで保存)脳の明確な視界を維持するために連続して。皮質組織は淡いピンク色で、その下の脳梁は白い線維性組織として現れ、海馬のCA1層は暗赤色と灰色です。組織の表面が滑らかになり、CA1の広い領域が露出したら、吸引を停止します(図3)。注:この手順は、手順全体を成功させるために重要であり、多くの場合、最も難しい部分です。この手順のトラブルシューティングに役立つ一般的な問題のリストを提供しています(表1)。さらに、傷口を冷たい生理食塩水で連続的にすすぐと、出血をある程度減らすことができます。針が詰まった場合。詰まった針をシリンジに取り付け、詰まりを洗い流します。これが機能しない場合は、針を交換してみてください。 出血が一定である場合、脳組織の視界を遮る可能性があります。これが発生した場合は、血液が凝固するのを待ってから、生理食塩水ですすいでください。 ドリルで開けた穴の上にホルダーを移動します。GRINレンズが脳組織の表面に接触したときのZ軸を0にします。GRINレンズが穴の直径を超える場合は、マイクロドリルを使用して穴を広げます。その後、この手順を繰り返します。 GRINレンズをD/Vの穴に挿入します:-1.32mm。ホルダーを5〜10分間放置します。ホルダーを上げた後、生理食塩水で穴をすすいでください。この手順を3回繰り返します(図4A)。注:このステップ中に脳組織が出血するのは正常です。生理食塩水を繰り返しすすぎた後、穴に血液がなくなるはずです。このステップは画像品質に大きく影響され、血液がクリーンアップされないと、画像フィールドが黒くなる原因となる可能性があります。 生理食塩水を使用して頭蓋骨を完全に洗浄し、頭蓋骨を乾かしてからUVレジンを塗布します。 針を使ってGRINレンズの周りにUV樹脂を塗布します。この領域をUVライトで15秒間照らし、UV樹脂が固まることを確認します(図4B)。注意: UV樹脂を一度に少しずつ塗布し、GRINレンズの周囲が覆われるまでこの操作を数回繰り返します。照明にUVライトを使用する際は、GRINレンズをホルダーに貼り付けないように注意してください。 GRINレンズからホルダーを慎重に取り外します。露出した頭蓋骨全体をUV樹脂で覆い、頭蓋骨のヘッドプレートを適切な位置に置きます。頭蓋骨とヘッドプレート全体をUVライトで15秒間照らします(図4C)。注意: ヘッドプレートは、ベースプレートを取り付けるときにマウスのヘッドを所定の位置にしっかりと保持するためのコンポーネントです(補足 を参照してください File デザインについては1 )。ヘッドプレートをできるだけしっかりと固定します。ヘッドプレートが外れると、手術全体が失敗します。私たちの経験では、UV樹脂を徹底的に塗布することで、しっかりとした接着が得られるはずです。より強力なアタッチメントが必要な場合は、頭蓋骨ネジの取り付けを検討できます。 露出したGRINレンズを3Dプリントされた保護キャップで覆います(デザインについては 補足ファイル2 を参照してください)。M1.6ネジを使用してキャップをヘッドプレートに固定します(図4D)。 術後の炎症を防ぐために、手術後にデキサメタゾンを腹腔内注射(0.9%生理食塩水、2mg / kgに溶解)します。.さらに、カルプロフェン(0.9%生理食塩水に溶解、5 mg / kg)の皮下注射を投与して、術後の痛みを軽減します。. マウスをケージに戻し、回復を容易にするためにサーマルブランケットに移します。その後、マウスが自由に動けるようになったら、実験動物舎に移します。注:戦闘によるベースプレートの損傷を避けるために、手術を受けたマウスは個別に、または最小限の数の同居動物で飼育することができます。手術後、ケージ内のマウスが3匹を超えないようにすることをお勧めします。 10%漂白剤溶液を使用して作業面を消毒します。使い捨ての個人用保護具(PPE)を取り外し、バイオハザードバッグに廃棄してください。 手術後3日間、マウスを毎日観察します。マウスの体重を記録し、創傷治癒状況や運動活動を観察します。デキサメタゾンとカルプロフェン溶液(ステップ2.13と同じ投与量)の腹腔内注射を3日間毎日提供します。.必要に応じて回復を促進するために、湿った食事または治療を提供します。 3.イメージングフィールドの品質を確認します 注:マウスは、最初の in vivo カルシウムイメージングセッションの前に、手術後2〜3週間で回復します。このステップの目的は、手術の質とマウスの回復を確認することです。イメージングフィールドでシングルセル活性が観察され、マウスの状態が良好な場合は、マウスの頭蓋骨にベースプレートを貼り付けます。マウスは、画像の品質や健康状態が適切でない場合は、頸部脱臼によって安楽死させる必要があります。 ミニスコープデータ収集ボックスをUSB3.0ケーブルでコンピューターに接続します。次に、同軸ケーブルを To Scope コネクタ(SMA)を介してボックスに接続します。 ミニスコープ制御ソフトウェアの電源を入れます。ソフトウェアで、[ Select Config File |ユーザー設定ファイルV4に加えて 、ライブ画像を表示します。 カスタマイズされたホルダーを使用して、ヘッドプレートをクランプすることにより、マウスをランニングホイールに保持します。ミニスコープホルダー(3Dプリント製、 補足を参照 )でミニスコープを持ち、固定装置を使用してミニスコープをマウスの頭の上に動かします(図4E)。 ドライバーでキャップを取り外します。GRINレンズの表面を75%エタノールで優しく拭きます。ミニスコープを露出したGRINレンズのすぐ上に置き、スコープの底面をレンズの表面と平行にします。ミニスコープをゆっくりとGRINレンズに向かって下げて、最適な焦点面を見つけます。注意: 焦点面を0に設定してから、ミニスコープの位置を調整します。これにより、フォーカスを調整するためのスペースが広がります。最大数の細胞が明確に視覚化された焦点面を選択します。 ミニスコープ制御ソフトウェアで、LEDライトの電力を最適なレベルに調整します。注:シングルセルの活性を観察するには、イメージングフィールドが露出オーバーでなく、暗すぎないようにする必要があります。 LEDの強度 は通常 10%以内です。 血管の血流が見られ、細胞がイメージングフィールド全体に多数で均一に分布している場合は、実験の次のセクションに進みます。注:このステップでは、シングルセルの活性を観察できることが重要です。これは、データ分析の結果に影響を与える可能性があります。通常、局所的な活動(蛍光揺らぎの塊)は解釈が困難です。これは、標的ニューロンがGRINレンズの焦点から外れていることを示している可能性があります。イメージングフィールドが黒色である、細胞が局所活性を示す、または細胞の数が不十分であると思われる場合、マウスはその後の実験では使用されません。 ミニスコープからケーブルを外します。 4.ミニスコープベースプレートをマウスの頭蓋骨に取り付けます ベースプレートをミニスコープに取り付け、ミニスコープの位置を再調整して、良好な画像品質のフィールドを取得します。 ミキシングボウルで義歯の基材を混ぜます。注:混合物が自由に流れすぎたり、固すぎたりしないことが重要です。流動性が高すぎると、GRINレンズの表面が覆い、撮像視野が失われやすくなります。硬すぎると、義歯のベース材料がベースプレートとヘッドプレートの間の隙間をしっかりと覆うことができません。 ミニスコープのベースプレートの周りに義歯ベース材料の最初の層を慎重に適用しながら、ミニスコープの位置を変えないように注意してください。セメントの最初の層が固まるのを待ってから、ベースプレートからヘッドプレートにセメントの2番目の層を塗布します。すべての義歯ベース材料が硬化した後、止めネジを緩め、ミニスコープをベースプレートから取り外します。注:義歯の基材を使用する場合は、ソフトウェアのイメージングフィールドに注意を払い、セメントが固まる前に必要な調整を行ってください。 ミニスコープから保持アームをそっと取り外します。 ベースプレートキャップをベースプレートに入れて露出したGRINレンズを保護し、止めネジを締めます(図4F)。 マウスをホームケージに戻します。行動実験を行う前に、マウスが回復するまで数日待ちます。 5. データ取得 注: In vivo カルシウムイメージングは、任意の挙動試験と同時に実行できます。このプロトコルでは、例として線形トラックを使用します。この直線的なトラックは1.5mで、両端に水があり、ネズミのご褒美として機能します。マウスはミニチュア顕微鏡(ミニスコープ)を装着し、20分間トラックに沿って前後に走ることができます。この間、マウスは通常、~60回の試行を実行できます。 ミニスコープデータ収集ボックスをUSB3.0ケーブルでコンピューターに接続します。次に、同軸ケーブルを To Scope (SMA)コネクタを介してボックスに接続します。 ミニスコープ制御ソフトウェアの電源を入れます。miniscope制御ソフトウェアで、 Select Config File |ユーザー設定ファイルV4に加えて 、ライブ画像を表示します。 産業用カメラをUSB3.0ケーブルでコンピューターに接続します。 カメラ制御ソフトウェアの電源を入れます。ソフトウェアで、[ Open Equipment]をクリックし、データ収集パラメータをインポートするファイルを選択します。ビデオ形式として [AVI コンテナ内の非圧縮ビデオ] を選択します。 [スタート ] ボタンをクリックして、ライブ画像を表示します。注意: ビヘイビア録画ビデオのファイルサイズを小さくするには、視野をトラックの外側の不要な領域から除外する必要があります。 カスタマイズされたホルダーを使用して、ヘッドプレートをクランプすることにより、マウスをランニングホイールに保持します。 ドライバーで止めネジを緩め、ベースプレートキャップを取り外し、GRINレンズの表面を75%エタノールで清掃します。 ミニスコープをベースに取り付けます。ミニスコープをマウスの頭のベースに固定します。 焦点面ボタンをスライドして、最適な焦点面を見つけます。 マウスを走行ホイールからリニアトラックにゆっくりと動かします。 [録音]ボタンを押し続けると、ミニスコープで録音が開始されます。次に、 収集を開始 ボタンをクリックして、カメラの録画を開始します。20分間録画します。 in vivoカルシウムイメージングデータ、行動データ、Arduinoデータを別々に保存します。これらのファイルに日付、セッション番号、およびマウス番号で名前を付けます。注:ミニスコープを使用する研究では、単一の実験動物に対して長期的なデータ収集期間を設ける傾向があります。ファイルに明確な名前を付けると、データ処理手順に役立ちます。 ミニスコープをベースから取り外します。 カメラ制御ソフトウェア、ミニスコープ制御ソフトウェア、およびコンピューターを閉じます。 To Scope(SMA)から同軸ケーブルを外し、カメラからUSB 3.0ケーブルを外します。 ベースの止めネジを緩め、ベースプレートキャップを元に戻し、ネジを締めます。 マウスをホームケージに戻します。 6. データ処理 記録したカルシウムイメージングデータを MATLAB に読み込みます。注:データの分析は実験計画に合わせて調整する必要があることを認識しています。ここでは、生のカルシウムイメージングビデオを個々の細胞からの活性トレースに変換する前処理パイプラインを提供します。この手順は比較的普遍的で、ユーザーにとって有用であると考えています。このセクションで説明するすべてのスクリプトは、 補足ファイル 4 にあります。 イメージングデータをAVIからHDF5(.h5)形式に変換します。注意: ミニスコープの生の出力は、圧縮されたAVIファイルを生成します。非圧縮ファイルのサイズは、通常、数十ギガバイトです。HDF5 ファイル形式では、仮想アクセスと部分アクセスが可能で、簡単に視覚化して、その後の分析のために操作できます。 非剛体運動補正(NoRMCorre)を適用します19。 モーション補正されたムービーをダウンサンプリングします。これは、後の手順でコンピューターの RAM が制限されている場合に備えてのことです。注意: ミニスコープによって収集された元のデータのサイズは600 x 600です。空間ダウンサンプルを使用することで、ビデオサイズを200 x 200に縮小できます。この方法により、データストレージの要件が大幅に削減され、データ処理が高速になります。 オンラインリポジトリ20 (https://github.com/schnitzer-lab/EXTRACT-public)のEXTRACTコードの指示に従って、シングルセルシグナルを同定するために、ダウンサンプリングされたデータにEXTRACTを適用する。

Representative Results

図1 は、ウイルス注入、GRINレンズ埋め込み、ベースプレート固定、ミニスコープによる in vivo カルシウムイメージング、データ処理などの実験手順の概略図を示しています。通常、全体の手続きには1か月かかります。 図2 は、頭蓋骨に開けられた穴の位置やGRINレンズ移植前の脳組織の状態など、ウイルス注入の手順の例を示しています。</…

Discussion

ここでは、マウスのDGにおける in vivo カルシウムイメージングの手順について説明しました。このプロトコルは、さまざまな認知プロセスにおけるDG機能の研究を目指す研究者、特に遺伝的に同定された亜集団が関心のある場合に有用であると考えています。ここでは、手術におけるいくつかの重要なポイントを強調しながら、私たちのプロトコルの利点を説明し、この方法の限界につ…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、復旦大学21TQ1400100(22TQ019)、上海市科学技術メジャープロジェクト、臨港研究所(助成金番号。LG-QS-202203-09)および中国国家自然科学基金会(32371036)。

Materials

200 μL universal pipette tips Transcat Pipettes 1030-260-000-9 For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips) iSmile 20-0105 For removing the brain tissue
3D printed protective cap N/A N/A To protect the GRIN Lens
75% ethanol Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd bwsj-230219105303 For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus Brain Case BC-0083 For viral injection
Adobe Illustrator Adobe cc 2018 version 22.1 To draw figures
Anesthesia air pump RWD Life Science Co.,Ltd R510-30 For anesthesia
Camera control software Daheng Imaging Galaxy Windows SDK_CN (V2) For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder) RWD Life Science Co.,Ltd 68214 To hold the GRIN lens
Carprofen MedChemExpress 53716-49-7 To reduce postoperative pain of the mouse 
Coax Cable Open ephys CW8251 To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope Olympus Life Science  FV3000 For observing the brain slices
Cotton swab Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd 20202140438 For disinfection
Customized headplate N/A N/A For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder N/A N/A To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing) New Centry Dental 430205 For attaching the miniscope
Depilatory cream Veet ASIN : B001DUUPQ0 For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M RWD Life Science Co.,Ltd 68803 For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone Huachu Co., Ltd. N/A To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope RWD Life Science Co., Ltd MZ62-WX For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6 RWD Life Science Co.,Ltd R510-31-6 For anesthesia
GRIN lens GoFoton CLHS100GFT003 For GRIN lens implantation
GRIN lens InFocus Grin Corp SIH-100-043-550-0D0-NC For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm) RWD Life Science Co.,Ltd V100 For anesthesia
Industrial camera Daheng Imaging MER-231-41U3M-L, VS-0618H1 For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd 8861F6DFC92A For disinfection
Isoflurane RWD Life Science Co.,Ltd R510-22-10 For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III) Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X For viral injection
MATLAB MathWorks R2021b For analyzing the data
Microdrill RWD Life Science Co.,Ltd 78001 For craniotomy
Micropipette puller Narishige International USA PC-100 For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410 For viral injection
Miniscope DAQ Software Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software) N/A For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3) Open ephys V3.3 To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4 Open ephys V4 For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2) Open ephys Variant 2 For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific Company 3-000-207 For viral injection
Ophthalmic ointment Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd. H37022025 To keep the eyes moist
PCR tube LabServ 309101009 For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad) Lenovo 20W0-005UCD To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd NA-H115 For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws) Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) 60902 To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws) Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) S2 For unscrew the set screws
Set screw TBD 2-56 cone point set screw For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine RWD Life Science Co.,Ltd R500 For anesthesia
Sterile syringe Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD 20163140236 For rinse the blood
Surgical scissors RWD Life Science Co.,Ltd S14016-13 For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl. RWD Life Science Co.,Ltd 69027 To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps RWD Life Science Co.,Ltd F11020-11 For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable Open ephys N/A To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light Jinshida 66105854002 To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive) Loctite 32268 To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump Kylin-Bell GL-802B To remove the blood, saline and the brain tissue

参考文献

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記事を引用
Han, S., Ding, N., Li, C., Yuan, P. In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice . J. Vis. Exp. (210), e66916, doi:10.3791/66916 (2024).

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