Summary

تصوير الكالسيوم في الجسم الحي للخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن للحصين في الفئران

Published: August 02, 2024
doi:

Summary

يؤدي التلفيف المسنن للحصين وظائف أساسية ومتميزة في التعلم والذاكرة. يصف هذا البروتوكول مجموعة من الإجراءات القوية والفعالة لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي للخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن في الفئران التي تتحرك بحرية.

Abstract

عادة ما تكون هناك حاجة إلى نهج في الوقت الفعلي في دراسات التعلم والذاكرة ، ويوفر تصوير الكالسيوم في الجسم الحي إمكانية التحقيق في النشاط العصبي في المستيقظة أثناء المهام السلوكية. نظرا لأن الحصين يرتبط ارتباطا وثيقا بالذاكرة العرضية والمكانية ، فقد أصبح منطقة دماغية أساسية في أبحاث هذا المجال. في الأبحاث الحديثة ، تمت دراسة خلايا engram وخلايا المكان من خلال تسجيل الأنشطة العصبية في منطقة الحصين CA1 باستخدام المجهر المصغر في الفئران أثناء أداء المهام السلوكية بما في ذلك المجال المفتوح والمسار الخطي. على الرغم من أن التلفيف المسنن هو منطقة مهمة أخرى في الحصين ، إلا أنه نادرا ما تمت دراسته باستخدام التصوير في الجسم الحي نظرا لعمقه الأكبر وصعوبة التصوير. في هذا البروتوكول ، نقدم بالتفصيل عملية تصوير الكالسيوم ، بما في ذلك كيفية حقن الفيروس ، وزرع عدسة GRIN (مؤشر التدرج) ، وإرفاق لوحة قاعدة لتصوير التلفيف المسنن للحصين. كما وصفنا كيفية المعالجة المسبقة لبيانات تصوير الكالسيوم باستخدام MATLAB. بالإضافة إلى ذلك ، قد تستفيد الدراسات التي أجريت على مناطق الدماغ العميقة الأخرى التي تتطلب التصوير من هذه الطريقة.

Introduction

وجدت الدراسات السابقة أن الحصين هو بنية دماغية ضرورية لمعالجة واسترجاع الذكريات 1,2. منذ خمسينيات القرن العشرين ، كانت الدوائر العصبية للحصين في القوارض محور التركيز في دراسة تكوين الذاكرة وتخزينها واسترجاعها3. تشمل الهياكل التشريحية داخل الحصين المناطق الفرعية للتلفيف المسنن (DG) و CA1 و CA2 و CA3 و CA4 و subiculum4. توجد اتصالات ثنائية الاتجاه معقدة بين هذه المناطق الفرعية ، والتي تشكل DG و CA1 و CA3 دائرة ثلاثية المشابك بارزة تتكون من خلايا حبيبية وخلايا هرمية5. تتلقى هذه الدائرة مدخلاتها الأولية من القشرة المخية الداخلية (EC) وكانت نموذجا كلاسيكيا لدراسة اللدونة المشبكية. ركزت الأبحاث السابقة في الجسم الحي على وظيفة الحصين في الغالب على CA1 6,7 نظرا لسهولة الوصول إليها. بينما تلعب الخلايا العصبية CA1 أدوارا مهمة في تكوين الذاكرة وتوحيدها واسترجاعها ، لا سيما في الخلايا المكانية للذاكرة المكانية ، فإن المناطق الفرعية الأخرى من الحصين حيوية أيضا 8,9. على وجه الخصوص ، أبرزت الدراسات الحديثة وظائف DG في تكوين الذاكرة. تم الإبلاغ عن أن الخلايا المكانية في DG أكثر استقرارا من تلك الموجودة في CA110 ، وتعكس أنشطتها معلومات خاصة بالسياق11. علاوة على ذلك ، يمكن إعادة تنشيط وضع العلامات المعتمدة على النشاط لخلايا حبيبات DG للحث على السلوكيات المتعلقة بالذاكرة12. لذلك ، للحصول على فهم أعمق لتشفير المعلومات في DG ، من الأهمية بمكان التحقيق في أنشطة المنطقة دون الإقليمية DG أثناء قيام بمهام تعتمد على الذاكرة.

استخدمت الدراسات السابقة لأنشطة DG في الغالب في الفيزيولوجيا الكهربيةللكائن الحي 13. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لها بعض العيوب: أولا ، في التسجيلات الكهربائية ، قد يكون من الصعب تحديد الأنواع المختلفة من الخلايا التي تولد الإشارة مباشرة. الإشارات المسجلة هي من كل من الخلايا المثبطة والإثارة. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من طرق معالجة البيانات لفصل هذين النوعين من الخلايا. علاوة على ذلك ، من الصعب الجمع بين معلومات نوع الخلية الأخرى ، مثل المجموعات الفرعية الخاصة بالإسقاط أو العلامات المعتمدة على النشاط ، مع التسجيلات الكهربائية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للتشكل التشريحي ل DG ، غالبا ما يتم زرع أقطاب التسجيل في اتجاه متعامد ، مما يحد بشكل كبير من عدد الخلايا العصبية التي يمكن تسجيلها. وبالتالي ، من الصعب على التسجيلات الكهربائية تحقيق مراقبة مئات الخلايا العصبية الفردية من بنية DG في نفس14.

تقنية تكميلية لتسجيل أنشطة الخلايا العصبية في DG هي استخدامها في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي 15. أيونات الكالسيوم أساسية لعمليات الإشارات الخلوية في الكائنات الحية ، وتلعب دورا حاسما في العديد من الوظائف الفسيولوجية ، خاصة داخل الجهاز العصبي للثدييات. عندما تكون الخلايا العصبية نشطة ، يزداد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا بسرعة ، مما يعكس الطبيعة الديناميكية للنشاط العصبي ونقل الإشارات. لذلك ، فإن تسجيل التغيرات في الوقت الفعلي في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العصبية يوفر رؤى مهمة حول آليات الترميز العصبي.

تستخدم تقنية تصوير الكالسيوم أصباغ الفلورسنت المتخصصة أو مؤشرات الكالسيوم المعدلة وراثيا (GECIs) لمراقبة تركيزات أيونات الكالسيوم في الخلايا العصبية عن طريق اكتشاف التغيرات في شدة التألق ، والتي يمكن التقاطها بعد ذلك من خلال التصوير المجهري16. بشكل عام ، يتم استخدام عائلة GCaMP لجينات مؤشر الكالسيوم ، والتي تضم بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، والكالمودولين ، وتسلسل عديد الببتيد M13. يمكن أن ينبعث GCaMP من مضان أخضر عندما يرتبط بأيونات الكالسيوم17 ، مما يسمح بتسجيل التقلبات في التألق الأخضر عبر التصوير18. بالإضافة إلى ذلك ، للحصول على صور واضحة لمنطقة الدماغ المستهدفة ، عادة ما يتم زرع عدسة مؤشر التدرج (عدسة GRIN) فوق المنطقة المعنية. تتيح عدسة GRIN تصوير منطقة الدماغ العميقة التي لا يمكن الوصول إليها مباشرة من السطح.

من السهل نسبيا دمج هذه التقنية مع الأدوات الجينية الأخرى لتسمية أنواع الخلايا المختلفة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن مستوى التصوير مواز لاتجاه الخلايا في DG ، يمكن الوصول إلى مئات الخلايا العصبية للتصوير مع كل عملية جراحية ناجحة. في هذا العمل ، نقدم بروتوكول جراحة كامل ومفصل لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي في التلفيف المسنن في الفئران (الشكل 1). يتضمن الإجراء عمليتين رئيسيتين. الأول هو حقن فيروس AAV-CaMKIIα-GCaMP6f في DG. العملية الثانية هي زرع عدسة GRIN فوق موقع حقن الفيروس. يتم إجراء هذين الإجراءين في نفس الجلسة. بعد التعافي من هذه العمليات الجراحية ، فإن الخطوة التالية هي التحقق من جودة التصوير باستخدام المجاهر المصغرة (المناظير الصغيرة). إذا كان مجال التصوير يحتوي على مئات الخلايا النشطة ، فإن الإجراء اللاحق هو إرفاق لوحة قاعدة المنظار الصغير على جمجمة الفأر باستخدام الأسمنت السني. يمكن بعد ذلك استخدام الماوس لتجارب التصوير. نقدم أيضا خط أنابيب المعالجة المسبقة المستند إلى MATLAB لتبسيط تحليل بيانات الكالسيوم التي تم جمعها.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في جامعة فودان (202109004S). جميع المستخدمة في هذه الدراسة كانت C57BL / 6J البالغة من العمر 6 أشهر. تم استخدام كلا الجنسين. تم الاحتفاظ بالفئران في دورة ضوئية مدتها 12 ساعة ، من الساعة 8 صباحا حتى 8 مساء. استخدمنا الإحداثي?…

Representative Results

يوضح الشكل 1 الرسم التخطيطي للإجراء التجريبي ، بما في ذلك حقن الفيروس ، وزرع عدسة GRIN ، وتثبيت لوحة القاعدة ، وتصوير الكالسيوم في الجسم الحي عبر منظار صغير ، ومعالجة البيانات. عموما ، يستغرق الإجراء بأكمله 1 شهر. يوضح الشكل 2 أمثلة على إجراءات حقن الفيروس …

Discussion

وصفنا هنا إجراء لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي في DG للفئران. نعتقد أن هذا البروتوكول سيكون مفيدا للباحثين الذين يهدفون إلى دراسة وظائف DG في العمليات المعرفية المختلفة ، لا سيما في الحالات التي تكون فيها مجموعة فرعية محددة وراثيا ذات أهمية. نوضح هنا مزايا بروتوكولنا ، مع التركيز على ب?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل من قبل برنامج شنغهاي التجريبي للبحوث الأساسية – جامعة فودان 21TQ1400100 (22TQ019) ، والمشروع الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا البلدية في شنغهاي ، ومختبر Lingang (رقم المنحة. LG-QS-202203-09) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32371036).

Materials

200 μL universal pipette tips Transcat Pipettes 1030-260-000-9 For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips) iSmile 20-0105 For removing the brain tissue
3D printed protective cap N/A N/A To protect the GRIN Lens
75% ethanol Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd bwsj-230219105303 For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus Brain Case BC-0083 For viral injection
Adobe Illustrator Adobe cc 2018 version 22.1 To draw figures
Anesthesia air pump RWD Life Science Co.,Ltd R510-30 For anesthesia
Camera control software Daheng Imaging Galaxy Windows SDK_CN (V2) For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder) RWD Life Science Co.,Ltd 68214 To hold the GRIN lens
Carprofen MedChemExpress 53716-49-7 To reduce postoperative pain of the mouse 
Coax Cable Open ephys CW8251 To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope Olympus Life Science  FV3000 For observing the brain slices
Cotton swab Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd 20202140438 For disinfection
Customized headplate N/A N/A For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder N/A N/A To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing) New Centry Dental 430205 For attaching the miniscope
Depilatory cream Veet ASIN : B001DUUPQ0 For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M RWD Life Science Co.,Ltd 68803 For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone Huachu Co., Ltd. N/A To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope RWD Life Science Co., Ltd MZ62-WX For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6 RWD Life Science Co.,Ltd R510-31-6 For anesthesia
GRIN lens GoFoton CLHS100GFT003 For GRIN lens implantation
GRIN lens InFocus Grin Corp SIH-100-043-550-0D0-NC For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm) RWD Life Science Co.,Ltd V100 For anesthesia
Industrial camera Daheng Imaging MER-231-41U3M-L, VS-0618H1 For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd 8861F6DFC92A For disinfection
Isoflurane RWD Life Science Co.,Ltd R510-22-10 For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III) Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X For viral injection
MATLAB MathWorks R2021b For analyzing the data
Microdrill RWD Life Science Co.,Ltd 78001 For craniotomy
Micropipette puller Narishige International USA PC-100 For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410 For viral injection
Miniscope DAQ Software Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software) N/A For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3) Open ephys V3.3 To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4 Open ephys V4 For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2) Open ephys Variant 2 For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific Company 3-000-207 For viral injection
Ophthalmic ointment Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd. H37022025 To keep the eyes moist
PCR tube LabServ 309101009 For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad) Lenovo 20W0-005UCD To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd NA-H115 For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws) Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) 60902 To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws) Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) S2 For unscrew the set screws
Set screw TBD 2-56 cone point set screw For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine RWD Life Science Co.,Ltd R500 For anesthesia
Sterile syringe Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD 20163140236 For rinse the blood
Surgical scissors RWD Life Science Co.,Ltd S14016-13 For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl. RWD Life Science Co.,Ltd 69027 To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps RWD Life Science Co.,Ltd F11020-11 For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable Open ephys N/A To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light Jinshida 66105854002 To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive) Loctite 32268 To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump Kylin-Bell GL-802B To remove the blood, saline and the brain tissue

References

  1. Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).
  2. Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O’keefe, J. Bilateral hippocampal pathology impairs topographical and episodic memory but not visual pattern matching. Hippocampus. 11 (6), 715-725 (2001).
  3. Kandel, E. R., Spencer, W. A. Cellular neurophysiological approaches in the study of learning. Physiol Rev. 48 (1), 65-134 (1968).
  4. Zemla, R., Basu, J. Hippocampal function in rodents. Curr Opin Neurobiol. 43, 187-197 (2017).
  5. Basu, J., Siegelbaum, S. A. The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a021733 (2015).
  6. Gobbo, F., et al. Neuronal signature of spatial decision-making during navigation by freely moving rats by using calcium imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2212152119 (2022).
  7. Schuette, P. J., et al. Gabaergic ca1 neurons are more stable following context changes than glutamatergic cells. Sci Rep. 12 (1), 10310 (2022).
  8. Daumas, S., Halley, H., Francés, B., Lassalle, J. M. Encoding, consolidation, and retrieval of contextual memory: Differential involvement of dorsal ca3 and ca1 hippocampal subregions. Learn Mem. 12 (4), 375-382 (2005).
  9. Ognjanovski, N., et al. Erratum: Parvalbumin-expressing interneurons coordinate hippocampal network dynamics required for memory consolidation. Nat Commun. 8, 16120 (2017).
  10. Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
  11. Yassa, M. A., Stark, C. E. L. Pattern separation in the hippocampus. Trends Neurosci. 34 (10), 515-525 (2011).
  12. Ryan, T. J., Roy, D. S., Pignatelli, M., Arons, A., Tonegawa, S. Memory. Engram cells retain memory under retrograde amnesia. Science. 348 (6238), 1007-1013 (2015).
  13. Manahan-Vaughan, D., Reymann, K. G., Brown, R. E. In vivo electrophysiological investigations into the role of histamine in the dentate gyrus of the rat. Neuroscience. 84 (3), 783-790 (1998).
  14. Kim, S., Jung, D., Royer, S. Place cell maps slowly develop via competitive learning and conjunctive coding in the dentate gyrus. Nat Commun. 11 (1), 4550 (2020).
  15. Danielson, N. B., et al. In vivo imaging of dentate gyrus mossy cells in behaving mice. Neuron. 93 (3), 552-559.e4 (2017).
  16. Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  17. Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for gcamp6m’s ca2+-dependent change in fluorescence. PLoS One. 12 (2), e0170934 (2017).
  18. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  19. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. Normcorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).
  20. Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. bioRxiv. , (2021).
  21. Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging. J Vis Exp. (176), (2021).
  22. Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. In vivo multi-day calcium imaging of ca1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields. J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).
  23. Masala, N., et al. Aberrant hippocampal Ca2+ micro-waves following synapsin-dependent adeno-associated viral expression of Ca2+ indicators. bioRxiv. , (2024).
  24. Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. -. T. An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation. J Neurosci Methods. 311, 83-88 (2019).
  25. Hsiao, Y. -. T., Wang, A. Y. -. C., Lee, T. -. Y., Chang, C. -. Y. Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice. J Vis Exp. (172), e62611 (2021).
  26. Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. A wireless miniscope for deep brain imaging in freely moving mice. J Neurosci Methods. 323, 56-60 (2019).
  27. Cholvin, T., Bartos, M. Hemisphere-specific spatial representation by hippocampal granule cells. Nat Commun. 13 (1), 6227 (2022).
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

Cite This Article
Han, S., Ding, N., Li, C., Yuan, P. In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice . J. Vis. Exp. (210), e66916, doi:10.3791/66916 (2024).

View Video