يؤدي التلفيف المسنن للحصين وظائف أساسية ومتميزة في التعلم والذاكرة. يصف هذا البروتوكول مجموعة من الإجراءات القوية والفعالة لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي للخلايا الحبيبية في التلفيف المسنن في الفئران التي تتحرك بحرية.
عادة ما تكون هناك حاجة إلى نهج في الوقت الفعلي في دراسات التعلم والذاكرة ، ويوفر تصوير الكالسيوم في الجسم الحي إمكانية التحقيق في النشاط العصبي في المستيقظة أثناء المهام السلوكية. نظرا لأن الحصين يرتبط ارتباطا وثيقا بالذاكرة العرضية والمكانية ، فقد أصبح منطقة دماغية أساسية في أبحاث هذا المجال. في الأبحاث الحديثة ، تمت دراسة خلايا engram وخلايا المكان من خلال تسجيل الأنشطة العصبية في منطقة الحصين CA1 باستخدام المجهر المصغر في الفئران أثناء أداء المهام السلوكية بما في ذلك المجال المفتوح والمسار الخطي. على الرغم من أن التلفيف المسنن هو منطقة مهمة أخرى في الحصين ، إلا أنه نادرا ما تمت دراسته باستخدام التصوير في الجسم الحي نظرا لعمقه الأكبر وصعوبة التصوير. في هذا البروتوكول ، نقدم بالتفصيل عملية تصوير الكالسيوم ، بما في ذلك كيفية حقن الفيروس ، وزرع عدسة GRIN (مؤشر التدرج) ، وإرفاق لوحة قاعدة لتصوير التلفيف المسنن للحصين. كما وصفنا كيفية المعالجة المسبقة لبيانات تصوير الكالسيوم باستخدام MATLAB. بالإضافة إلى ذلك ، قد تستفيد الدراسات التي أجريت على مناطق الدماغ العميقة الأخرى التي تتطلب التصوير من هذه الطريقة.
وجدت الدراسات السابقة أن الحصين هو بنية دماغية ضرورية لمعالجة واسترجاع الذكريات 1,2. منذ خمسينيات القرن العشرين ، كانت الدوائر العصبية للحصين في القوارض محور التركيز في دراسة تكوين الذاكرة وتخزينها واسترجاعها3. تشمل الهياكل التشريحية داخل الحصين المناطق الفرعية للتلفيف المسنن (DG) و CA1 و CA2 و CA3 و CA4 و subiculum4. توجد اتصالات ثنائية الاتجاه معقدة بين هذه المناطق الفرعية ، والتي تشكل DG و CA1 و CA3 دائرة ثلاثية المشابك بارزة تتكون من خلايا حبيبية وخلايا هرمية5. تتلقى هذه الدائرة مدخلاتها الأولية من القشرة المخية الداخلية (EC) وكانت نموذجا كلاسيكيا لدراسة اللدونة المشبكية. ركزت الأبحاث السابقة في الجسم الحي على وظيفة الحصين في الغالب على CA1 6,7 نظرا لسهولة الوصول إليها. بينما تلعب الخلايا العصبية CA1 أدوارا مهمة في تكوين الذاكرة وتوحيدها واسترجاعها ، لا سيما في الخلايا المكانية للذاكرة المكانية ، فإن المناطق الفرعية الأخرى من الحصين حيوية أيضا 8,9. على وجه الخصوص ، أبرزت الدراسات الحديثة وظائف DG في تكوين الذاكرة. تم الإبلاغ عن أن الخلايا المكانية في DG أكثر استقرارا من تلك الموجودة في CA110 ، وتعكس أنشطتها معلومات خاصة بالسياق11. علاوة على ذلك ، يمكن إعادة تنشيط وضع العلامات المعتمدة على النشاط لخلايا حبيبات DG للحث على السلوكيات المتعلقة بالذاكرة12. لذلك ، للحصول على فهم أعمق لتشفير المعلومات في DG ، من الأهمية بمكان التحقيق في أنشطة المنطقة دون الإقليمية DG أثناء قيام بمهام تعتمد على الذاكرة.
استخدمت الدراسات السابقة لأنشطة DG في الغالب في الفيزيولوجيا الكهربيةللكائن الحي 13. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لها بعض العيوب: أولا ، في التسجيلات الكهربائية ، قد يكون من الصعب تحديد الأنواع المختلفة من الخلايا التي تولد الإشارة مباشرة. الإشارات المسجلة هي من كل من الخلايا المثبطة والإثارة. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من طرق معالجة البيانات لفصل هذين النوعين من الخلايا. علاوة على ذلك ، من الصعب الجمع بين معلومات نوع الخلية الأخرى ، مثل المجموعات الفرعية الخاصة بالإسقاط أو العلامات المعتمدة على النشاط ، مع التسجيلات الكهربائية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للتشكل التشريحي ل DG ، غالبا ما يتم زرع أقطاب التسجيل في اتجاه متعامد ، مما يحد بشكل كبير من عدد الخلايا العصبية التي يمكن تسجيلها. وبالتالي ، من الصعب على التسجيلات الكهربائية تحقيق مراقبة مئات الخلايا العصبية الفردية من بنية DG في نفس14.
تقنية تكميلية لتسجيل أنشطة الخلايا العصبية في DG هي استخدامها في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي 15. أيونات الكالسيوم أساسية لعمليات الإشارات الخلوية في الكائنات الحية ، وتلعب دورا حاسما في العديد من الوظائف الفسيولوجية ، خاصة داخل الجهاز العصبي للثدييات. عندما تكون الخلايا العصبية نشطة ، يزداد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا بسرعة ، مما يعكس الطبيعة الديناميكية للنشاط العصبي ونقل الإشارات. لذلك ، فإن تسجيل التغيرات في الوقت الفعلي في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العصبية يوفر رؤى مهمة حول آليات الترميز العصبي.
تستخدم تقنية تصوير الكالسيوم أصباغ الفلورسنت المتخصصة أو مؤشرات الكالسيوم المعدلة وراثيا (GECIs) لمراقبة تركيزات أيونات الكالسيوم في الخلايا العصبية عن طريق اكتشاف التغيرات في شدة التألق ، والتي يمكن التقاطها بعد ذلك من خلال التصوير المجهري16. بشكل عام ، يتم استخدام عائلة GCaMP لجينات مؤشر الكالسيوم ، والتي تضم بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، والكالمودولين ، وتسلسل عديد الببتيد M13. يمكن أن ينبعث GCaMP من مضان أخضر عندما يرتبط بأيونات الكالسيوم17 ، مما يسمح بتسجيل التقلبات في التألق الأخضر عبر التصوير18. بالإضافة إلى ذلك ، للحصول على صور واضحة لمنطقة الدماغ المستهدفة ، عادة ما يتم زرع عدسة مؤشر التدرج (عدسة GRIN) فوق المنطقة المعنية. تتيح عدسة GRIN تصوير منطقة الدماغ العميقة التي لا يمكن الوصول إليها مباشرة من السطح.
من السهل نسبيا دمج هذه التقنية مع الأدوات الجينية الأخرى لتسمية أنواع الخلايا المختلفة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن مستوى التصوير مواز لاتجاه الخلايا في DG ، يمكن الوصول إلى مئات الخلايا العصبية للتصوير مع كل عملية جراحية ناجحة. في هذا العمل ، نقدم بروتوكول جراحة كامل ومفصل لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي في التلفيف المسنن في الفئران (الشكل 1). يتضمن الإجراء عمليتين رئيسيتين. الأول هو حقن فيروس AAV-CaMKIIα-GCaMP6f في DG. العملية الثانية هي زرع عدسة GRIN فوق موقع حقن الفيروس. يتم إجراء هذين الإجراءين في نفس الجلسة. بعد التعافي من هذه العمليات الجراحية ، فإن الخطوة التالية هي التحقق من جودة التصوير باستخدام المجاهر المصغرة (المناظير الصغيرة). إذا كان مجال التصوير يحتوي على مئات الخلايا النشطة ، فإن الإجراء اللاحق هو إرفاق لوحة قاعدة المنظار الصغير على جمجمة الفأر باستخدام الأسمنت السني. يمكن بعد ذلك استخدام الماوس لتجارب التصوير. نقدم أيضا خط أنابيب المعالجة المسبقة المستند إلى MATLAB لتبسيط تحليل بيانات الكالسيوم التي تم جمعها.
وصفنا هنا إجراء لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي في DG للفئران. نعتقد أن هذا البروتوكول سيكون مفيدا للباحثين الذين يهدفون إلى دراسة وظائف DG في العمليات المعرفية المختلفة ، لا سيما في الحالات التي تكون فيها مجموعة فرعية محددة وراثيا ذات أهمية. نوضح هنا مزايا بروتوكولنا ، مع التركيز على ب?…
The authors have nothing to disclose.
يتم دعم هذا العمل من قبل برنامج شنغهاي التجريبي للبحوث الأساسية – جامعة فودان 21TQ1400100 (22TQ019) ، والمشروع الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا البلدية في شنغهاي ، ومختبر Lingang (رقم المنحة. LG-QS-202203-09) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32371036).
200 μL universal pipette tips | Transcat Pipettes | 1030-260-000-9 | For removing the blood and saline |
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips) | iSmile | 20-0105 | For removing the brain tissue |
3D printed protective cap | N/A | N/A | To protect the GRIN Lens |
75% ethanol | Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd | bwsj-230219105303 | For disinfection and cleaning the GRIN lens surface |
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus | Brain Case | BC-0083 | For viral injection |
Adobe Illustrator | Adobe | cc 2018 version 22.1 | To draw figures |
Anesthesia air pump | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-30 | For anesthesia |
Camera control software | Daheng Imaging | Galaxy Windows SDK_CN (V2) | For recording the behavioral data |
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder) | RWD Life Science Co.,Ltd | 68214 | To hold the GRIN lens |
Carprofen | MedChemExpress | 53716-49-7 | To reduce postoperative pain of the mouse |
Coax Cable | Open ephys | CW8251 | To connect the miniscope and the miniscope DAQ box |
Confocal microscope | Olympus Life Science | FV3000 | For observing the brain slices |
Cotton swab | Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd | 20202140438 | For disinfection |
Customized headplate | N/A | N/A | For holding the mouse on the running wheel |
Customized headplate holder | N/A | N/A | To hold the headplate of the mouse |
Denture base matierlals (self-curing) | New Centry Dental | 430205 | For attaching the miniscope |
Depilatory cream | Veet | ASIN : B001DUUPQ0 | For removing the hair of the mouse |
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M | RWD Life Science Co.,Ltd | 68803 | For viral injection and GRIN lens implantation |
Dexamethasone | Huachu Co., Ltd. | N/A | To prevent postoperative inflammation of the mouse |
Dissecting microscope | RWD Life Science Co., Ltd | MZ62-WX | For observing the conditions during surgeries |
Gas filter canister, large, packge of 6 | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-31-6 | For anesthesia |
GRIN lens | GoFoton | CLHS100GFT003 | For GRIN lens implantation |
GRIN lens | InFocus Grin Corp | SIH-100-043-550-0D0-NC | For GRIN lens implantation |
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm) | RWD Life Science Co.,Ltd | V100 | For anesthesia |
Industrial camera | Daheng Imaging | MER-231-41U3M-L, VS-0618H1 | For acquiring the behavioral data |
Iodophor disinfectant | Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd | 8861F6DFC92A | For disinfection |
Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22-10 | For anesthesia |
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | For viral injection |
MATLAB | MathWorks | R2021b | For analyzing the data |
Microdrill | RWD Life Science Co.,Ltd | 78001 | For craniotomy |
Micropipette puller | Narishige International USA | PC-100 | For pulling the liquid sample collection tube |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | For viral injection |
Miniscope DAQ Software | Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software) | N/A | For recording the calcium imaging data |
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3) | Open ephys | V3.3 | To acquire the calcium imaging data |
Miniscope V4 | Open ephys | V4 | For in vivo calcium imaging |
Miniscope V4 base plate (Variant 2) | Open ephys | Variant 2 | For holding the miniscope |
nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-207 | For viral injection |
Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd. | H37022025 | To keep the eyes moist |
PCR tube | LabServ | 309101009 | For dilue the virus |
Personal Computer (ThinkPad) | Lenovo | 20W0-005UCD | To record the calcium imaging data and behavioral data |
Running wheel | Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd | NA-H115 | For holding the mouse when affixing the base plate |
Screwdriver (M1.6 screws) | Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) | 60902 | To unscrew the M1.6 screws |
Screwdriver (set screws) | Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) | S2 | For unscrew the set screws |
Set screw | TBD | 2-56 cone point set screw | For fasten the miniscope to its base plate |
Small animal anesthesia machine | RWD Life Science Co.,Ltd | R500 | For anesthesia |
Sterile syringe | Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD | 20163140236 | For rinse the blood |
Surgical scissors | RWD Life Science Co.,Ltd | S14016-13 | For cutting off the hair and scalp |
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl. | RWD Life Science Co.,Ltd | 69027 | To maintain the animal's body temperature |
Ultra fine forceps | RWD Life Science Co.,Ltd | F11020-11 | For removing the bone debris and dura |
USB 3.0 cable | Open ephys | N/A | To connect the miniscope DAQ box and the computer |
UV light | Jinshida | 66105854002 | To fix the GRIN lens on the skull |
UV resin (light cure adhesive) | Loctite | 32268 | To fix the GRIN lens on the skull |
Vacuum pump | Kylin-Bell | GL-802B | To remove the blood, saline and the brain tissue |
.