海馬の歯状回は、学習と記憶において重要で明確な機能を果たします。このプロトコルは、自由に動くマウスの歯状回における顆粒細胞の in vivo カルシウムイメージングのための一連の堅牢で効率的な手順を説明しています。
学習と記憶の研究には通常、リアルタイムのアプローチが必要であり、 in vivo カルシウムイメージングは、行動課題中の覚醒動物のニューロン活動を調査する可能性を提供します。海馬はエピソード記憶や空間記憶と密接に関連しているため、この分野の研究において重要な脳領域となっています。近年の研究では、海馬CA1領域の神経活動を小型顕微鏡を用いて記録し、マウスを用いてオープンフィールドやリニアトラックなどの行動課題を行いながら、エングラム細胞や場所細胞を研究しています。歯状回は海馬のもう一つの重要な領域ですが、その深さが深く、イメージングが難しいため、 in vivo イメージングで研究されることはほとんどありませんでした。このプロトコルでは、ウイルスの注入方法、GRIN(Gradient-index)レンズの埋め込み方法、海馬の歯状回をイメージングするためのベースプレートの取り付け方法など、カルシウムイメージングプロセスを詳細に提示します。さらに、MATLAB を使用してカルシウムイメージング データを前処理する方法についても説明します。さらに、イメージングが必要な他の脳深部領域の研究も、この方法の恩恵を受ける可能性があります。
これまでの研究では、海馬は記憶の処理や想起に不可欠な脳の構造であることがわかっています1,2。1950年代以降、げっ歯類の海馬の神経回路は、記憶の形成、保存、および検索の研究において焦点となってきました3。海馬内の解剖学的構造には、歯状回(DG)、CA1、CA2、CA3、CA4、およびsubiculum4の亜領域が含まれます。これらのサブリージョン間には複雑な双方向の接続が存在し、そのうちDG、CA1、およびCA3は、顆粒細胞と錐体細胞5からなる顕著な三シナプス回路を形成しています。この回路は、嗅内皮質(EC)から主要な入力を受け取り、シナプスの可塑性を研究するための古典的なモデルとなっています。海馬機能に関する以前のin vivo研究は、そのアクセスの容易さから、主にCA1 6,7に集中していました。CA1ニューロンは、記憶の形成、固定、および検索において重要な役割を果たしますが、特に空間記憶のための細胞では、海馬の他のサブ領域も重要です8,9。特に、最近の研究では、記憶形成におけるDGの機能が注目されています。DGの場所細胞はCA110の場所細胞よりも安定していることが報告されており、その活動は状況特異的な情報を反映している11。さらに、DG顆粒細胞の活性依存的な標識は、記憶関連の行動を誘導するために再活性化することができる12。したがって、DGの情報コーディングをより深く理解するためには、動物が記憶依存的なタスクを実行している間のDG亜領域の活動を調査することが重要です。
DG活性に関する先行研究では、主に in vivo 電気生理学13が用いられてきた。しかし、この手法にはいくつかの欠点があります:まず、電気記録では、シグナルを生成しているさまざまな種類の細胞を直接特定することが難しい場合があります。記録されたシグナルは、抑制性細胞と興奮性細胞の両方からのものです。したがって、これら2つの細胞タイプを分離するためには、さらなるデータ処理方法が必要となる。さらに、プロジェクション特異的なサブグループや活性依存的な標識など、他の細胞型情報を電気記録と組み合わせることは困難です。さらに、DGの解剖学的形態により、記録電極は直交方向に埋め込まれることが多く、記録できるニューロンの数が大幅に制限されます。したがって、電気記録が同一動物14のDG構造から数百の個々のニューロンをモニタリングすることは困難である。
DGにおけるニューロン活動を記録する補完的な技術は、 in vivo カルシウムイメージング15を使用することである。カルシウムイオンは、生物の細胞シグナル伝達プロセスの基本であり、特に哺乳類の神経系における多くの生理学的機能において重要な役割を果たしています。ニューロンが活動しているとき、細胞内のカルシウム濃度は急速に増加し、これはニューロンの活動とシグナル伝達の動的な性質を反映しています。したがって、ニューロンの細胞内カルシウムレベルのリアルタイムな変化を記録することは、神経コードメカニズムに関する重要な洞察を提供します。
カルシウムイメージング技術は、特殊な蛍光色素または遺伝子組み換えカルシウムインジケーター(GECI)を利用して、蛍光強度の変化を検出することによりニューロン内のカルシウムイオン濃度をモニターし、それを顕微鏡イメージング16で捉えることができる。一般に、緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン、およびM13ポリペプチド配列を含むカルシウム指標遺伝子のGCaMPファミリーが採用されます。GCaMPは、カルシウムイオン17に結合すると緑色蛍光を発することができ、緑色蛍光の変動をイメージング18を通じて記録することができる。さらに、標的の脳領域の鮮明な画像を得るために、通常、グラディエントインデックスレンズ(GRINレンズ)を関心領域の上に埋め込む。GRINレンズは、表面から直接アクセスできない脳深部領域のイメージングを可能にします。
この手法は、他の遺伝ツールと組み合わせて、さまざまな細胞タイプを標識するのに比較的簡単です。さらに、イメージング面はDGの細胞の向きと平行であるため、手術が成功するたびに数百のニューロンがイメージングに利用できます。この研究では、マウスの歯状回における in vivo カルシウムイメージングのための完全で詳細な手術プロトコルを紹介します(図1)。この手順には、2つの主要な操作が含まれます。1つ目は、AAV-CaMKIIα-GCaMP6fウイルスをDGに注入することです。2つ目の手術は、ウイルス注入部位の上にGRINレンズを埋め込むことです。これら2つの手順は、同じ座り方で行われます。これらの手術から回復した後、次のステップは、小型顕微鏡(ミニスコープ)でイメージング品質を確認することです。イメージングフィールドに数百の活性細胞がある場合、その後の手順は、歯科用セメントを使用してミニスコープベースプレートをマウスの頭蓋骨に取り付けることです。その後、マウスをイメージング実験に使用できます。また、収集されたカルシウムデータの解析を効率化するためのMATLABベースの前処理パイプラインについても紹介します。
ここでは、マウスのDGにおける in vivo カルシウムイメージングの手順について説明しました。このプロトコルは、さまざまな認知プロセスにおけるDG機能の研究を目指す研究者、特に遺伝的に同定された亜集団が関心のある場合に有用であると考えています。ここでは、手術におけるいくつかの重要なポイントを強調しながら、私たちのプロトコルの利点を説明し、この方法の限界につ…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、復旦大学21TQ1400100(22TQ019)、上海市科学技術メジャープロジェクト、臨港研究所(助成金番号。LG-QS-202203-09)および中国国家自然科学基金会(32371036)。
200 μL universal pipette tips | Transcat Pipettes | 1030-260-000-9 | For removing the blood and saline |
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips) | iSmile | 20-0105 | For removing the brain tissue |
3D printed protective cap | N/A | N/A | To protect the GRIN Lens |
75% ethanol | Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd | bwsj-230219105303 | For disinfection and cleaning the GRIN lens surface |
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus | Brain Case | BC-0083 | For viral injection |
Adobe Illustrator | Adobe | cc 2018 version 22.1 | To draw figures |
Anesthesia air pump | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-30 | For anesthesia |
Camera control software | Daheng Imaging | Galaxy Windows SDK_CN (V2) | For recording the behavioral data |
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder) | RWD Life Science Co.,Ltd | 68214 | To hold the GRIN lens |
Carprofen | MedChemExpress | 53716-49-7 | To reduce postoperative pain of the mouse |
Coax Cable | Open ephys | CW8251 | To connect the miniscope and the miniscope DAQ box |
Confocal microscope | Olympus Life Science | FV3000 | For observing the brain slices |
Cotton swab | Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd | 20202140438 | For disinfection |
Customized headplate | N/A | N/A | For holding the mouse on the running wheel |
Customized headplate holder | N/A | N/A | To hold the headplate of the mouse |
Denture base matierlals (self-curing) | New Centry Dental | 430205 | For attaching the miniscope |
Depilatory cream | Veet | ASIN : B001DUUPQ0 | For removing the hair of the mouse |
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M | RWD Life Science Co.,Ltd | 68803 | For viral injection and GRIN lens implantation |
Dexamethasone | Huachu Co., Ltd. | N/A | To prevent postoperative inflammation of the mouse |
Dissecting microscope | RWD Life Science Co., Ltd | MZ62-WX | For observing the conditions during surgeries |
Gas filter canister, large, packge of 6 | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-31-6 | For anesthesia |
GRIN lens | GoFoton | CLHS100GFT003 | For GRIN lens implantation |
GRIN lens | InFocus Grin Corp | SIH-100-043-550-0D0-NC | For GRIN lens implantation |
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm) | RWD Life Science Co.,Ltd | V100 | For anesthesia |
Industrial camera | Daheng Imaging | MER-231-41U3M-L, VS-0618H1 | For acquiring the behavioral data |
Iodophor disinfectant | Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd | 8861F6DFC92A | For disinfection |
Isoflurane | RWD Life Science Co.,Ltd | R510-22-10 | For anesthesia |
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III) | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | For viral injection |
MATLAB | MathWorks | R2021b | For analyzing the data |
Microdrill | RWD Life Science Co.,Ltd | 78001 | For craniotomy |
Micropipette puller | Narishige International USA | PC-100 | For pulling the liquid sample collection tube |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | For viral injection |
Miniscope DAQ Software | Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software) | N/A | For recording the calcium imaging data |
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3) | Open ephys | V3.3 | To acquire the calcium imaging data |
Miniscope V4 | Open ephys | V4 | For in vivo calcium imaging |
Miniscope V4 base plate (Variant 2) | Open ephys | Variant 2 | For holding the miniscope |
nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company | 3-000-207 | For viral injection |
Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd. | H37022025 | To keep the eyes moist |
PCR tube | LabServ | 309101009 | For dilue the virus |
Personal Computer (ThinkPad) | Lenovo | 20W0-005UCD | To record the calcium imaging data and behavioral data |
Running wheel | Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd | NA-H115 | For holding the mouse when affixing the base plate |
Screwdriver (M1.6 screws) | Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) | 60902 | To unscrew the M1.6 screws |
Screwdriver (set screws) | Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) | S2 | For unscrew the set screws |
Set screw | TBD | 2-56 cone point set screw | For fasten the miniscope to its base plate |
Small animal anesthesia machine | RWD Life Science Co.,Ltd | R500 | For anesthesia |
Sterile syringe | Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD | 20163140236 | For rinse the blood |
Surgical scissors | RWD Life Science Co.,Ltd | S14016-13 | For cutting off the hair and scalp |
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl. | RWD Life Science Co.,Ltd | 69027 | To maintain the animal's body temperature |
Ultra fine forceps | RWD Life Science Co.,Ltd | F11020-11 | For removing the bone debris and dura |
USB 3.0 cable | Open ephys | N/A | To connect the miniscope DAQ box and the computer |
UV light | Jinshida | 66105854002 | To fix the GRIN lens on the skull |
UV resin (light cure adhesive) | Loctite | 32268 | To fix the GRIN lens on the skull |
Vacuum pump | Kylin-Bell | GL-802B | To remove the blood, saline and the brain tissue |
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