Summary

マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング

Published: August 02, 2024
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Summary

海馬の歯状回は、学習と記憶において重要で明確な機能を果たします。このプロトコルは、自由に動くマウスの歯状回における顆粒細胞の in vivo カルシウムイメージングのための一連の堅牢で効率的な手順を説明しています。

Abstract

学習と記憶の研究には通常、リアルタイムのアプローチが必要であり、 in vivo カルシウムイメージングは、行動課題中の覚醒動物のニューロン活動を調査する可能性を提供します。海馬はエピソード記憶や空間記憶と密接に関連しているため、この分野の研究において重要な脳領域となっています。近年の研究では、海馬CA1領域の神経活動を小型顕微鏡を用いて記録し、マウスを用いてオープンフィールドやリニアトラックなどの行動課題を行いながら、エングラム細胞や場所細胞を研究しています。歯状回は海馬のもう一つの重要な領域ですが、その深さが深く、イメージングが難しいため、 in vivo イメージングで研究されることはほとんどありませんでした。このプロトコルでは、ウイルスの注入方法、GRIN(Gradient-index)レンズの埋め込み方法、海馬の歯状回をイメージングするためのベースプレートの取り付け方法など、カルシウムイメージングプロセスを詳細に提示します。さらに、MATLAB を使用してカルシウムイメージング データを前処理する方法についても説明します。さらに、イメージングが必要な他の脳深部領域の研究も、この方法の恩恵を受ける可能性があります。

Introduction

これまでの研究では、海馬は記憶の処理や想起に不可欠な脳の構造であることがわかっています1,2。1950年代以降、げっ歯類の海馬の神経回路は、記憶の形成、保存、および検索の研究において焦点となってきました3。海馬内の解剖学的構造には、歯状回(DG)、CA1、CA2、CA3、CA4、およびsubiculum4の亜領域が含まれます。これらのサブリージョン間には複雑な双方向の接続が存在し、そのうちDG、CA1、およびCA3は、顆粒細胞と錐体細胞5からなる顕著な三シナプス回路を形成しています。この回路は、嗅内皮質(EC)から主要な入力を受け取り、シナプスの可塑性を研究するための古典的なモデルとなっています。海馬機能に関する以前のin vivo研究は、そのアクセスの容易さから、主にCA1 6,7に集中していました。CA1ニューロンは、記憶の形成、固定、および検索において重要な役割を果たしますが、特に空間記憶のための細胞では、海馬の他のサブ領域も重要です8,9。特に、最近の研究では、記憶形成におけるDGの機能が注目されています。DGの場所細胞はCA110の場所細胞よりも安定していることが報告されており、その活動は状況特異的な情報を反映している11。さらに、DG顆粒細胞の活性依存的な標識は、記憶関連の行動を誘導するために再活性化することができる12。したがって、DGの情報コーディングをより深く理解するためには、動物が記憶依存的なタスクを実行している間のDG亜領域の活動を調査することが重要です。

DG活性に関する先行研究では、主に in vivo 電気生理学13が用いられてきた。しかし、この手法にはいくつかの欠点があります:まず、電気記録では、シグナルを生成しているさまざまな種類の細胞を直接特定することが難しい場合があります。記録されたシグナルは、抑制性細胞と興奮性細胞の両方からのものです。したがって、これら2つの細胞タイプを分離するためには、さらなるデータ処理方法が必要となる。さらに、プロジェクション特異的なサブグループや活性依存的な標識など、他の細胞型情報を電気記録と組み合わせることは困難です。さらに、DGの解剖学的形態により、記録電極は直交方向に埋め込まれることが多く、記録できるニューロンの数が大幅に制限されます。したがって、電気記録が同一動物14のDG構造から数百の個々のニューロンをモニタリングすることは困難である。

DGにおけるニューロン活動を記録する補完的な技術は、 in vivo カルシウムイメージング15を使用することである。カルシウムイオンは、生物の細胞シグナル伝達プロセスの基本であり、特に哺乳類の神経系における多くの生理学的機能において重要な役割を果たしています。ニューロンが活動しているとき、細胞内のカルシウム濃度は急速に増加し、これはニューロンの活動とシグナル伝達の動的な性質を反映しています。したがって、ニューロンの細胞内カルシウムレベルのリアルタイムな変化を記録することは、神経コードメカニズムに関する重要な洞察を提供します。

カルシウムイメージング技術は、特殊な蛍光色素または遺伝子組み換えカルシウムインジケーター(GECI)を利用して、蛍光強度の変化を検出することによりニューロン内のカルシウムイオン濃度をモニターし、それを顕微鏡イメージング16で捉えることができる。一般に、緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン、およびM13ポリペプチド配列を含むカルシウム指標遺伝子のGCaMPファミリーが採用されます。GCaMPは、カルシウムイオン17に結合すると緑色蛍光を発することができ、緑色蛍光の変動をイメージング18を通じて記録することができる。さらに、標的の脳領域の鮮明な画像を得るために、通常、グラディエントインデックスレンズ(GRINレンズ)を関心領域の上に埋め込む。GRINレンズは、表面から直接アクセスできない脳深部領域のイメージングを可能にします。

この手法は、他の遺伝ツールと組み合わせて、さまざまな細胞タイプを標識するのに比較的簡単です。さらに、イメージング面はDGの細胞の向きと平行であるため、手術が成功するたびに数百のニューロンがイメージングに利用できます。この研究では、マウスの歯状回における in vivo カルシウムイメージングのための完全で詳細な手術プロトコルを紹介します(図1)。この手順には、2つの主要な操作が含まれます。1つ目は、AAV-CaMKIIα-GCaMP6fウイルスをDGに注入することです。2つ目の手術は、ウイルス注入部位の上にGRINレンズを埋め込むことです。これら2つの手順は、同じ座り方で行われます。これらの手術から回復した後、次のステップは、小型顕微鏡(ミニスコープ)でイメージング品質を確認することです。イメージングフィールドに数百の活性細胞がある場合、その後の手順は、歯科用セメントを使用してミニスコープベースプレートをマウスの頭蓋骨に取り付けることです。その後、マウスをイメージング実験に使用できます。また、収集されたカルシウムデータの解析を効率化するためのMATLABベースの前処理パイプラインについても紹介します。

Protocol

すべての動物手続きは、復旦大学の動物管理および使用委員会(202109004S)によって承認されました。この研究で使用されたすべての動物は、生後6か月のC57BL / 6Jでした。男女ともに使用しました。マウスを午前8時から午後8時まで12時間の光サイクルで飼育しました。脳表面からDG:A/P:-2.2mm、M/L:1.5mm、D/V:1.7mmの座標でウイルス注入を行いました。 1.歯状回へのウイルス注?…

Representative Results

図1 は、ウイルス注入、GRINレンズ埋め込み、ベースプレート固定、ミニスコープによる in vivo カルシウムイメージング、データ処理などの実験手順の概略図を示しています。通常、全体の手続きには1か月かかります。 図2 は、頭蓋骨に開けられた穴の位置やGRINレンズ移植前の脳組織の状態など、ウイルス注入の手順の例を示しています。</…

Discussion

ここでは、マウスのDGにおける in vivo カルシウムイメージングの手順について説明しました。このプロトコルは、さまざまな認知プロセスにおけるDG機能の研究を目指す研究者、特に遺伝的に同定された亜集団が関心のある場合に有用であると考えています。ここでは、手術におけるいくつかの重要なポイントを強調しながら、私たちのプロトコルの利点を説明し、この方法の限界につ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、復旦大学21TQ1400100(22TQ019)、上海市科学技術メジャープロジェクト、臨港研究所(助成金番号。LG-QS-202203-09)および中国国家自然科学基金会(32371036)。

Materials

200 μL universal pipette tips Transcat Pipettes 1030-260-000-9 For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips) iSmile 20-0105 For removing the brain tissue
3D printed protective cap N/A N/A To protect the GRIN Lens
75% ethanol Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd bwsj-230219105303 For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus Brain Case BC-0083 For viral injection
Adobe Illustrator Adobe cc 2018 version 22.1 To draw figures
Anesthesia air pump RWD Life Science Co.,Ltd R510-30 For anesthesia
Camera control software Daheng Imaging Galaxy Windows SDK_CN (V2) For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder) RWD Life Science Co.,Ltd 68214 To hold the GRIN lens
Carprofen MedChemExpress 53716-49-7 To reduce postoperative pain of the mouse 
Coax Cable Open ephys CW8251 To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope Olympus Life Science  FV3000 For observing the brain slices
Cotton swab Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd 20202140438 For disinfection
Customized headplate N/A N/A For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder N/A N/A To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing) New Centry Dental 430205 For attaching the miniscope
Depilatory cream Veet ASIN : B001DUUPQ0 For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M RWD Life Science Co.,Ltd 68803 For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone Huachu Co., Ltd. N/A To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope RWD Life Science Co., Ltd MZ62-WX For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6 RWD Life Science Co.,Ltd R510-31-6 For anesthesia
GRIN lens GoFoton CLHS100GFT003 For GRIN lens implantation
GRIN lens InFocus Grin Corp SIH-100-043-550-0D0-NC For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm) RWD Life Science Co.,Ltd V100 For anesthesia
Industrial camera Daheng Imaging MER-231-41U3M-L, VS-0618H1 For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd 8861F6DFC92A For disinfection
Isoflurane RWD Life Science Co.,Ltd R510-22-10 For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III) Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X For viral injection
MATLAB MathWorks R2021b For analyzing the data
Microdrill RWD Life Science Co.,Ltd 78001 For craniotomy
Micropipette puller Narishige International USA PC-100 For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410 For viral injection
Miniscope DAQ Software Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software) N/A For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3) Open ephys V3.3 To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4 Open ephys V4 For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2) Open ephys Variant 2 For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific Company 3-000-207 For viral injection
Ophthalmic ointment Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd. H37022025 To keep the eyes moist
PCR tube LabServ 309101009 For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad) Lenovo 20W0-005UCD To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd NA-H115 For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws) Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) 60902 To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws) Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) S2 For unscrew the set screws
Set screw TBD 2-56 cone point set screw For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine RWD Life Science Co.,Ltd R500 For anesthesia
Sterile syringe Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD 20163140236 For rinse the blood
Surgical scissors RWD Life Science Co.,Ltd S14016-13 For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl. RWD Life Science Co.,Ltd 69027 To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps RWD Life Science Co.,Ltd F11020-11 For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable Open ephys N/A To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light Jinshida 66105854002 To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive) Loctite 32268 To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump Kylin-Bell GL-802B To remove the blood, saline and the brain tissue

References

  1. Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).
  2. Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O’keefe, J. Bilateral hippocampal pathology impairs topographical and episodic memory but not visual pattern matching. Hippocampus. 11 (6), 715-725 (2001).
  3. Kandel, E. R., Spencer, W. A. Cellular neurophysiological approaches in the study of learning. Physiol Rev. 48 (1), 65-134 (1968).
  4. Zemla, R., Basu, J. Hippocampal function in rodents. Curr Opin Neurobiol. 43, 187-197 (2017).
  5. Basu, J., Siegelbaum, S. A. The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a021733 (2015).
  6. Gobbo, F., et al. Neuronal signature of spatial decision-making during navigation by freely moving rats by using calcium imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2212152119 (2022).
  7. Schuette, P. J., et al. Gabaergic ca1 neurons are more stable following context changes than glutamatergic cells. Sci Rep. 12 (1), 10310 (2022).
  8. Daumas, S., Halley, H., Francés, B., Lassalle, J. M. Encoding, consolidation, and retrieval of contextual memory: Differential involvement of dorsal ca3 and ca1 hippocampal subregions. Learn Mem. 12 (4), 375-382 (2005).
  9. Ognjanovski, N., et al. Erratum: Parvalbumin-expressing interneurons coordinate hippocampal network dynamics required for memory consolidation. Nat Commun. 8, 16120 (2017).
  10. Hainmueller, T., Bartos, M. Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus. Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).
  11. Yassa, M. A., Stark, C. E. L. Pattern separation in the hippocampus. Trends Neurosci. 34 (10), 515-525 (2011).
  12. Ryan, T. J., Roy, D. S., Pignatelli, M., Arons, A., Tonegawa, S. Memory. Engram cells retain memory under retrograde amnesia. Science. 348 (6238), 1007-1013 (2015).
  13. Manahan-Vaughan, D., Reymann, K. G., Brown, R. E. In vivo electrophysiological investigations into the role of histamine in the dentate gyrus of the rat. Neuroscience. 84 (3), 783-790 (1998).
  14. Kim, S., Jung, D., Royer, S. Place cell maps slowly develop via competitive learning and conjunctive coding in the dentate gyrus. Nat Commun. 11 (1), 4550 (2020).
  15. Danielson, N. B., et al. In vivo imaging of dentate gyrus mossy cells in behaving mice. Neuron. 93 (3), 552-559.e4 (2017).
  16. Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  17. Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for gcamp6m’s ca2+-dependent change in fluorescence. PLoS One. 12 (2), e0170934 (2017).
  18. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  19. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. Normcorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).
  20. Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. bioRxiv. , (2021).
  21. Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging. J Vis Exp. (176), (2021).
  22. Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. In vivo multi-day calcium imaging of ca1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields. J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).
  23. Masala, N., et al. Aberrant hippocampal Ca2+ micro-waves following synapsin-dependent adeno-associated viral expression of Ca2+ indicators. bioRxiv. , (2024).
  24. Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. -. T. An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation. J Neurosci Methods. 311, 83-88 (2019).
  25. Hsiao, Y. -. T., Wang, A. Y. -. C., Lee, T. -. Y., Chang, C. -. Y. Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice. J Vis Exp. (172), e62611 (2021).
  26. Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. A wireless miniscope for deep brain imaging in freely moving mice. J Neurosci Methods. 323, 56-60 (2019).
  27. Cholvin, T., Bartos, M. Hemisphere-specific spatial representation by hippocampal granule cells. Nat Commun. 13 (1), 6227 (2022).
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Han, S., Ding, N., Li, C., Yuan, P. In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice . J. Vis. Exp. (210), e66916, doi:10.3791/66916 (2024).

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