Summary

In vivo Calcium-Bildgebung von Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus bei Mäusen

Published: August 02, 2024
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Summary

Der Gyrus dentatus des Hippocampus erfüllt wesentliche und unterschiedliche Funktionen beim Lernen und Gedächtnis. Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe robuster und effizienter Verfahren für die in vivo Calciumbildgebung von Körnerzellen im Gyrus dentatus bei frei beweglichen Mäusen.

Abstract

Echtzeit-Ansätze werden in der Regel in Studien zu Lernen und Gedächtnis benötigt, und in vivo Calcium-Bildgebung bietet die Möglichkeit, die neuronale Aktivität bei wachen Tieren während Verhaltensaufgaben zu untersuchen. Da der Hippocampus eng mit dem episodischen und räumlichen Gedächtnis verbunden ist, ist er zu einer wesentlichen Hirnregion in der Forschung dieses Feldes geworden. In neueren Forschungen wurden Engrammzellen und Ortszellen untersucht, indem die neuronalen Aktivitäten in der hippokampalen CA1-Region mit dem Miniaturmikroskop bei Mäusen aufgezeichnet wurden, während sie Verhaltensaufgaben wie Open-Field- und Linear-Track durchführten. Obwohl der Gyrus dentatus eine weitere wichtige Region im Hippocampus ist, wurde er aufgrund seiner größeren Tiefe und Schwierigkeit der Bildgebung nur selten mit in vivo-Bildgebung untersucht. In diesem Protokoll stellen wir im Detail ein Calcium-Bildgebungsverfahren vor, einschließlich der Injektion des Virus, der Implantation einer GRIN-Linse (Gradientenindex) und des Anbringens einer Basisplatte zur Abbildung des Gyrus dentatus des Hippocampus. Wir beschreiben weiterhin, wie die Calcium-Imaging-Daten mit MATLAB vorverarbeitet werden können. Darüber hinaus können Studien an anderen tiefen Hirnregionen, die eine Bildgebung erfordern, von dieser Methode profitieren.

Introduction

Frühere Studien haben gezeigt, dass der Hippocampus eine Gehirnstruktur ist, die für die Verarbeitung und den Abruf von Erinnerungen unerlässlich ist 1,2. Seit den 1950er Jahren stehen die neuronalen Schaltkreise des Hippocampus bei Nagetieren im Mittelpunkt der Erforschung der Gedächtnisbildung, -speicherung und -abfrage3. Zu den anatomischen Strukturen innerhalb des Hippocampus gehören die Subregionen Gyrus dentatus (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 und Subiculum4. Zwischen diesen Subregionen bestehen komplexe bidirektionale Verbindungen, von denen DG, CA1 und CA3 einen prominenten trisynaptischen Schaltkreis bilden, der aus Körnerzellen und Pyramidenzellenbesteht 5. Dieser Schaltkreis erhält seinen primären Input vom entorhinalen Kortex (EC) und ist ein klassisches Modell für die Untersuchung der synaptischen Plastizität. Frühere in vivo-Forschungen zur Funktion des Hippocampus konzentrierten sich aufgrund des leichteren Zugangs hauptsächlich auf das CA1 6,7. Während CA1-Neuronen eine wichtige Rolle bei der Gedächtnisbildung, -konsolidierung und -abfrage spielen, insbesondere in Ortszellen für das räumliche Gedächtnis, sind auch andere Subregionen des Hippocampus von entscheidender Bedeutung 8,9. Neuere Studien haben insbesondere die Funktionen von DG bei der Gedächtnisbildung hervorgehoben. Es wurde berichtet, dass Ortszellen in DG stabiler sind als solche in CA110, und ihre Aktivitäten spiegeln kontextspezifische Informationenwider 11. Darüber hinaus kann die aktivitätsabhängige Markierung von DG-Körnerzellen reaktiviert werden, um gedächtnisbezogene Verhaltensweisen zu induzieren12. Um ein tieferes Verständnis der Informationskodierung in DG zu erlangen, ist es daher von entscheidender Bedeutung, die Aktivitäten der DG-Subregion zu untersuchen, während das Tier gedächtnisabhängige Aufgaben ausführt.

Frühere Studien zu den Tätigkeiten der GD haben sich hauptsächlich auf die In-vivo-Elektrophysiologie gestützt13. Diese Technik hat jedoch einige Nachteile: Erstens kann es bei elektrischen Aufzeichnungen schwierig sein, die verschiedenen Zelltypen, die das Signal erzeugen, direkt zu identifizieren. Die aufgezeichneten Signale stammen sowohl von inhibitorischen als auch von exzitatorischen Zellen. Daher sind weitere Datenverarbeitungsmethoden erforderlich, um diese beiden Zelltypen zu trennen. Darüber hinaus ist es schwierig, andere Zelltypinformationen, wie z.B. projektionsspezifische Untergruppen oder aktivitätsabhängige Markierungen, mit elektrischen Aufzeichnungen zu kombinieren. Darüber hinaus werden die Aufzeichnungselektroden aufgrund der anatomischen Morphologie von DG oft in orthogonaler Richtung implantiert, was die Anzahl der Neuronen, die aufgezeichnet werden können, stark einschränkt. Daher ist es für elektrische Aufzeichnungen schwierig, Hunderte von einzelnen Neuronen aus der DG-Struktur im selben Tierzu überwachen 14.

Eine ergänzende Technik zur Aufzeichnung von Neuronenaktivitäten bei DG ist die Verwendung von In-vivo-Calcium-Bildgebung 15. Kalziumionen sind grundlegend für zelluläre Signalprozesse in Organismen und spielen eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen Funktionen, insbesondere im Nervensystem von Säugetieren. Wenn Neuronen aktiv sind, steigt die intrazelluläre Kalziumkonzentration schnell an, was die dynamische Natur der neuronalen Aktivität und Signalübertragung widerspiegelt. Daher liefert die Aufzeichnung der Echtzeit-Veränderungen des intrazellulären Kalziumspiegels in Neuronen wichtige Einblicke in die neuronalen Kodierungsmechanismen.

Die Calcium-Imaging-Technologie verwendet spezielle Fluoreszenzfarbstoffe oder gentechnisch hergestellte Calcium-Indikatoren (GECIs), um die Calciumionenkonzentrationen in Neuronen zu überwachen, indem Änderungen der Fluoreszenzintensität erkannt werden, die dann durch mikroskopische Bildgebung erfasst werden können16. Üblicherweise wird die GCaMP-Familie von Kalziumindikatorgenen verwendet, die grün fluoreszierendes Protein (GFP), Calmodulin und M13-Polypeptidsequenzen umfasst. GCaMP kann grüne Fluoreszenz emittieren, wenn es an Kalziumionenbindet 17, so dass die Fluktuationen der grünen Fluoreszenz mittels Bildgebungaufgezeichnet werden können 18. Um klare Bilder der Zielregion des Gehirns zu erhalten, wird in der Regel eine Gradientenindexlinse (GRIN-Linse) über der interessierenden Region implantiert. Die GRIN-Linse ermöglicht die Bildgebung der tiefen Hirnregion, die von der Oberfläche aus nicht direkt zugänglich ist.

Diese Technik lässt sich relativ einfach mit anderen genetischen Werkzeugen kombinieren, um verschiedene Zelltypen zu markieren. Da die Bildgebungsebene parallel zur Orientierung der Zellen in DG verläuft, sind bei jeder erfolgreichen Operation Hunderte von Neuronen für die Bildgebung zugänglich. In dieser Arbeit stellen wir ein vollständiges und detailliertes Operationsprotokoll für die in vivo Calciumbildgebung im Gyrus dentatus bei Mäusen vor (Abbildung 1). Das Verfahren umfasst zwei große Operationen. Die erste besteht darin, das AAV-CaMKIIα-GCaMP6f-Virus in die DG zu injizieren. Die zweite Operation besteht darin, eine GRIN-Linse über der Virusinjektionsstelle zu implantieren. Diese beiden Verfahren werden in derselben Sitzung durchgeführt. Nach der Genesung von diesen Operationen erfolgt im nächsten Schritt die Überprüfung der Bildqualität mit miniaturisierten Mikroskopen (Miniskopen). Wenn das Bildgebungsfeld Hunderte von aktiven Zellen aufweist, besteht das anschließende Verfahren darin, die Basisplatte des Miniskops mit Zahnzement auf dem Schädel der Maus zu befestigen. Die Maus kann dann für bildgebende Experimente verwendet werden. Wir stellen auch eine MATLAB-basierte Preprocessing-Pipeline vor, um die Analyse der gesammelten Kalziumdaten zu rationalisieren.

Protocol

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Fudan University (202109004S) genehmigt. Bei allen in dieser Studie verwendeten Tieren handelte es sich um 6 Monate altes C57BL/6J; Es wurden beide Geschlechter verwendet. Die Mäuse wurden in einem 12-stündigen Lichtzyklus von 8 bis 20 Uhr gehalten. Wir verwendeten die folgenden Koordinaten für die Virusinjektion in DG: A/P: -2,2 mm, M/L: 1,5 mm, D/V: 1,7 mm von der Gehirnoberfläche. 1. Virusinjektion in den Gyrus dentatus Tragen Sie Schutzausrüstung, einschließlich steriler Einweghandschuhe und -kittel. Bereiten Sie die erforderlichen chirurgischen Instrumente, zwei Röhrchen mit 5 ml Kochsalzlösung (0,9 % NaCl [steril] oder künstliche Zerebrospinalflüssigkeit) und zwei 25 G Luer-Lock-Nadeln vor.HINWEIS: Alle chirurgischen Instrumente müssen vor der Operation gründlich sterilisiert werden. Wir haben das Autoklavieren bei hoher Temperatur (121-134 °C) und hohem Druck (20 psi) verwendet, um die chirurgischen Instrumente zu sterilisieren. Des Weiteren haben wir die Oberflächen mit Desinfektionsmitteln auf Alkoholbasis besprüht. Bei allen chirurgischen Eingriffen verwendeten wir 0,9 % sterile Kochsalzlösung. Die Instrumente wurden während der Operation intermittierend mit erhitzten Glasperlen sterilisiert. Bereiten Sie eine 10%ige Bleichlösung in Wasser vor, um alle Vorräte zu desinfizieren, die mit dem Virus in Kontakt kommen könnten. Verdünnen Sie das AAV-CaMKIIα-GCaMP6f-Virus bei Bedarf mit sterilisierter Kochsalzlösung und lagern Sie es im 4 °C Kühlschrank oder auf Eis. Der Ziel-Endtiter des Virus beträgt 1 × 1012 GC/ml.HINWEIS: Wir empfehlen, wiederholte Frost-Tau-Zyklen des Virus zu vermeiden, um die Integrität des Virus zu erhalten. Zu diesem Zweck aliquotieren wir das Virus, wenn es vom Hersteller erhalten wird, in der Regel in kleine Mengen (z. B. 2 μL pro Tube) und bewahren sie in einem -80 °C heißen Gefrierschrank auf. Das Virus sollte am Tag des Auftauens verwendet und nicht bei 4 °C gelagert werden, um es langfristig zu verwenden. Ziehe die Mikropipette mit einem Mikropipettenzieher zu einer feinen Spitze, schneide mit einer chirurgischen Schere einen kleinen Teil der Spitze ab und fülle das Röhrchen mit Mineralöl. Stellen Sie sicher, dass die Pipette normal Flüssigkeit saugen kann, und setzen Sie sie dann auf den Injektor.HINWEIS: Wir haben eine einstufige Zugmethode verwendet, bei der die Heizung auf ~60% der maximalen Leistung eingestellt ist. Für diesen Schritt können auch andere Abzieher verwendet werden. Das übergeordnete Ziel ist es, die Spitze mit einem Durchmesser von ~50-100 μm zu versehen; Ein zu kleiner Durchmesser beeinträchtigt den Durchfluss der Flüssigkeit; Zu dick kann das Gehirngewebe der Maus schädigen. Schalten Sie alle Instrumente ein, einschließlich des Mausanästhesiegeräts, des Temperaturhaltegeräts (Heizkissen) und der Vakuumpumpe. Messen Sie außerdem das Körpergewicht der Mäuse vor der Operation.HINWEIS: Während des Eingriffs überwachten wir die Atmung der Maus visuell und überprüften gelegentlich die Körpertemperatur, um sicherzustellen, dass sie in gutem Zustand war. Setzen Sie die Maus mit 2,5% Isofluran und 1 l Sauerstoff/min in die Gaskammer. Überwachen Sie die Atembedingungen der Maus, um den Anästhesiestatus zu beurteilen.HINWEIS: Die Atemfrequenz sollte etwa 1 Atemzug/s betragen, um die Maus bei guter Gesundheit zu halten. Nehmen Sie die Maus aus der Gaskammer und legen Sie sie auf den stereotaktischen Apparat. Stellen Sie sicher, dass die Maus ausreichend betäubt ist, bevor Sie mit der nächsten Operation beginnen. Testen Sie den Pedalrückzugsreflex, indem Sie die Fußballen beider Hinterfüße einklemmen. Wenn die Maus auf das Einklemmen des Fußballens reagiert, verabreichen Sie eine zusätzliche Anästhesie und testen Sie den Reflex erneut, bevor Sie fortfahren. Decken Sie die Mausnase mit einer Maske ab und stellen Sie die Isofluran-Flussrate auf 1,5% ein. Befestigen Sie den Mauskopf fest mit den Ohrbügeln (Abbildung 2A).HINWEIS: Achten Sie darauf, die Ohrbügel nicht zu fest an der Maus zu befestigen, da dies die Atmung der Maus leicht beeinträchtigen und in einigen Fällen zum Tod führen kann. Schneiden Sie die Oberseite des Kopfes der Maus mit einer chirurgischen Schere ab und verwenden Sie Enthaarungscreme, um alle Haarreste zu entfernen, bis die Haut vollständig freigelegt ist. Tragen Sie die Enthaarungscreme auf die Kopfhaut der Maus auf, lassen Sie sie ca. 5 Minuten einwirken und wischen Sie die Creme mit Gaze ab. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen der Maus auf. Desinfizieren Sie den haarlosen Bereich mit Iodophor-Desinfektionsmittel und 75% Ethanol mit Wattestäbchen. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere (oder einer Skalpellklinge) einen kontinuierlichen Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut und schneiden Sie einen Teil der Kopfhaut ab, um die Schädeloberfläche freizulegen (Abbildung 2B). Spülen Sie die Oberfläche des Schädels mit Kochsalzlösung ab. Entfernen Sie dann die Blende und überschüssige Kochsalzlösung mit einer Vakuumpumpe. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis der Bereich um die Wunde herum aufhört zu bluten. Wischen Sie die Oberfläche des Schädels mit Wattestäbchen ab, um sie trocken zu halten.HINWEIS: Es gibt andere Möglichkeiten, die Faszie zu entfernen, z. B. indem Sie sie mit einem Wattebausch oder Wattestäbchen abwischen. Verwenden Sie die Fixiernadel, um die Schädeloberfläche zu justieren, wenn Bregma und Lambda sichtbar sind. Nehmen Sie mehrere Einstellungen vor, bis der gesamte Kopf nivelliert ist (der gesamte Fehler in Richtung der Z-Achse beträgt weniger als 0,05 mm). Bewegen Sie die Spitze der Nadel vom Bregma in die entsprechende Zielposition. Verwenden Sie für die Zielkoordinaten das Bregma als Referenzpunkt. Markieren Sie die vier Punkte, um den Umfang der Virusinjektionsstelle zu definieren: A/P: -2,0 mm, M/L: -1,5 mm; A/P: -2,5 mm, M/L: -1,5 mm; A/P -2,25 mm, M/L: -1,0 mm; und A/P -2,25 mm, M/L: -2,0 mm, mit abwischbarem Marker.HINWEIS: Dieses Protokoll führt die Virusinjektion und die Implantation der GRIN-Linse in derselben Operation durch. In diesem Protokoll wurden alle Operationen an der rechten Hemisphäre durchgeführt, aber es ist denkbar, dass beide Hemisphären verwendet werden können. Injizieren Sie das Virus innerhalb des Injektionsbereichs, der durch die vier oben genannten Punkte definiert ist, in drei separaten Dosen von 80 nL an verschiedenen Stellen. Obwohl die drei Standorte willkürlich ausgewählt wurden, empfehlen wir, sie für eine bessere Virusverbreitung zu verteilen. Dadurch erhöht sich die Anzahl der infizierten Zellen. Machen Sie die Kraniotomie in der Region mit dem Mikrobohrer und setzen Sie diese vier Punkte als Grenze. Stoppen Sie das Bohren, wenn Hirngewebe sichtbar ist (Abbildung 2C).HINWEIS: Versuchen Sie, den Schädel langsam zu bohren. Der Bohrer kann das Hirngewebe durch übermäßige Krafteinwirkung schädigen. Langsames Bohren kann auch eine Überhitzung des Gehirns verhindern. Entfernen Sie die Knochenreste und Dura mit einer ultrafeinen Pinzette und spülen Sie diesen Bereich ständig mit steriler Kochsalzlösung ab.HINWEIS: Es ist normal, dass während dieses Schritts eine kleine Menge an Blutungen auftritt, da einige Kapillaren platzen; Spülen Sie einfach weiter mit Kochsalzlösung, bis keine Blutungen mehr auftreten. Verwenden Sie das Bedienfeld des Injektors, um etwas Mineralöl auszustoßen, um den erforderlichen Platz für die anschließende Beladung des Virus zu schaffen. Füllen Sie die Mikropipette mit mindestens 240 nL des verdünnten Virus bei einer Geschwindigkeit von 100 nL/s.HINWEIS: Luftblasen im Röhrchen sollten über das Bedienfeld abgelassen werden, um sicherzustellen, dass die Mikropipette die richtige Flüssigkeitsmenge abgibt. Wenn das Flüssigkeitsvolumen nach mehreren Versuchen immer noch ungenau ist, sollten Sie die Mikropipette austauschen und von vorne beginnen. Wir empfehlen, ein zusätzliches Virus als das tatsächliche Injektionsvolumen zu aspirieren. Dieser Ansatz verhindert die versehentliche Injektion von Mineralöl in das Gehirn der Maus. Bewegen Sie die Mikropipette über den Kraniotomiebereich; Bewegen Sie es dann langsam in das Hirngewebe bis zur angestrebten Z-Achse von D/V: 1,70 mm unter der Gehirnoberfläche.HINWEIS: Viele Referenzatlas verwenden die Schädeloberfläche als D/V 0. Unserer Erfahrung nach führte die Verwendung der Koordinaten von der Gehirnoberfläche zu einer zuverlässigeren Zielbestimmung für DG. Stellen Sie den Injektor über das Bedienfeld so ein, dass er 80 nL des Virus mit einer Durchflussrate von 1 nL/s injiziert (Abbildung 2D). Klicken Sie auf die Schaltfläche INJECT in der Systemsteuerung, um den Virus zu injizieren. Wählen Sie anschließend zwei weitere Positionen innerhalb der Kraniotomie aus und wiederholen Sie die vorherige Operation.HINWEIS: Jede Injektion dauert ~2 Minuten. Warten Sie nach Beendigung der Injektion weitere 8-10 Minuten, bevor Sie in eine andere Position wechseln. Wenn während der Entnahme Blutungen auftreten, waschen Sie sie sofort mit Kochsalzlösung. Entfernen Sie die Mikropipette langsam aus dem Gehirn (Abbildung 2E). 2. GRIN-Linsenimplantation im Gyrus dentatus HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt unmittelbar nach Abschluss der 240 nL Virusinjektion durch. Desinfizieren Sie die GRIN-Linse mit einem Durchmesser von 1 mm in 75 % Ethanol für 20 Minuten; Spülen Sie es vor der Implantation gründlich mit Kochsalzlösung ab. Erweitern Sie die Kraniotomie mit dem Mikrobohrer, um die Öffnung in A/P-Richtung auf ca. 1 mm zu vergrößern. Befreien Sie den Schmutz mit Kochsalzlösung. Klemmen Sie die GRIN-Linse mit einer Halterung fest und achten Sie darauf, dass eine ausreichende Länge belichtet ist.HINWEIS: Es ist einfach, den Halter auf die GRIN-Linse zu kleben, wenn Sie ihn in den folgenden Schritten mit UV-Harz am Schädel befestigen. Dies kann jedoch vermieden werden, wenn die belichtete Länge des Objektivs ausreichend ist. Bewegen Sie die GRIN-Linse mit der Halterung über den Kraniotomiebereich. Stellen Sie die Position der Z-Achse auf Null, wenn die Unterseite der GRIN-Linse die Oberfläche des Gehirngewebes berührt. Entfernen Sie dann den GRIN-Objektivhalter und legen Sie ihn beiseite. Befestigen Sie die 25-G-Luer-Lock-Nadel an dem Saugrohr der Vakuumpumpe und stellen Sie den Druck auf 0,04 MPa ein.HINWEIS: Wenn dieser Schritt zum ersten Mal durchgeführt wird, kann der Druck entsprechend reduziert werden, um das Hirngewebe langsam abzusaugen. Saugen Sie das Hirngewebe ab, indem Sie die Spitze der stumpfen Nadel dicht über dem Hirngewebe drehen und sanft auf das Hirngewebe drücken, um die Aspiration zu erleichtern. Spülen Sie während des Absaugens kontinuierlich mit Kochsalzlösung (bei 4 °C lagern), um eine klare Sicht auf das Gehirn zu erhalten. Beobachten Sie die Gewebemerkmale genau, um die Aspirationstiefe zu überwachen: Das kortikale Gewebe ist blassrosa, das Corpus callosum darunter erscheint als weißes, fibröses Gewebe und die hippocampale CA1-Schicht ist dunkelrot und grau. Stoppen Sie die Absaugung, wenn die Oberfläche des Gewebes glatt wird und ein großer Bereich von CA1 freigelegt wird (Abbildung 3).HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für den Erfolg des gesamten Verfahrens und oft der schwierigste Teil. Wir haben eine Liste mit häufig auftretenden Problemen zusammengestellt, um den Lesern bei der Fehlerbehebung bei diesem Schritt zu helfen (Tabelle 1). Des Weiteren empfehlen wir, die Wunde kontinuierlich mit kalter Kochsalzlösung zu spülen, da dadurch die Blutung etwas reduziert werden kann.Wenn die Nadel verstopft ist; Befestigen Sie die blockierte Nadel an einer Spritze und waschen Sie die Verstopfung aus. Versuchen Sie, die Nadel zu wechseln, wenn dies nicht funktioniert. Ist die Blutung konstant, kann sie die Sicht auf das Hirngewebe versperren. Warten Sie in diesem Fall, bis das Blut gerinnt, und spülen Sie es dann mit Kochsalzlösung aus. Schieben Sie den Halter über das Bohrloch. Stellen Sie die Z-Achse auf 0, wenn die GRIN-Linse die Oberfläche des Hirngewebes berührt. Wenn die GRIN-Linse den Durchmesser des Lochs überschreitet, verwenden Sie den Mikrobohrer, um das Loch zu erweitern. Wiederholen Sie dann diesen Vorgang. Setzen Sie die GRIN-Linse in das Loch bei D/V ein: -1,32 mm. Lassen Sie den Halter 5-10 min stehen. Nachdem Sie den Halter angehoben haben, spülen Sie das Loch mit Kochsalzlösung aus. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x (Abbildung 4A).HINWEIS: Es ist normal, dass das Hirngewebe während dieses Schritts blutet. Nach wiederholten Spülungen mit Kochsalzlösung sollte sich kein Blut mehr im Loch befinden. Die Bildqualität wird durch diesen Schritt stark beeinträchtigt, und wenn das Blut nicht gereinigt wird, kann dies dazu führen, dass das Bildfeld schwarz wird. Reinigen Sie den Schädel gründlich mit Kochsalzlösung und lassen Sie den Schädel dann trocknen, bevor Sie das UV-Harz auftragen. Tragen Sie das UV-Harz mit einer Nadel um die GRIN-Linse auf. Beleuchten Sie diesen Bereich 15 s lang mit einem UV-Licht und sorgen Sie dafür, dass das UV-Harz fest wird (Abbildung 4B).HINWEIS: Tragen Sie das UV-Harz nach und nach auf und wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, bis der Bereich um die GRIN-Linse bedeckt ist. Achten Sie darauf, die GRIN-Linse nicht an der Halterung zu befestigen, wenn Sie das UV-Licht zur Beleuchtung verwenden. Entfernen Sie vorsichtig die Halterung von der GRIN-Linse. Bedecken Sie den gesamten freiliegenden Schädel mit UV-Harz und platzieren Sie die Kopfplatte in der entsprechenden Position auf dem Schädel. Beleuchten Sie den gesamten Schädel und die Kopfplatte 15 s lang mit einem UV-Licht (Abbildung 4C).HINWEIS: Die Kopfplatte ist eine Komponente, mit der der Kopf der Maus sicher an Ort und Stelle gehalten werden kann, wenn die Grundplatte angebracht wird (siehe Zusatzdatei 1 für das Design). Befestigen Sie die Kopfplatte so fest wie möglich. Eine abgelöste Kopfplatte führt zum Scheitern der gesamten Operation. Unserer Erfahrung nach sollte ein gründliches Auftragen des UV-Harzes in der Lage sein, eine feste Haftung zu gewährleisten. Wenn eine stärkere Befestigung erforderlich ist, könnte man den Einbau von Schädelschrauben in Betracht ziehen. Decken Sie die freiliegende GRIN-Linse mit einer 3D-gedruckten Schutzkappe ab (siehe Zusatzdatei 2 für das Design). Befestigen Sie die Kappe mit M1.6-Schrauben an der Kopfplatte (Abbildung 4D). Injizieren Sie Dexamethason intraperitoneal (gelöst in 0,9% Kochsalzlösung, 2 mg/kg) nach der Operation, um eine postoperative Entzündung zu verhindern. Verabreichen Sie zusätzlich subkutane Injektionen von Carprofen (gelöst in 0,9 % Kochsalzlösung, 5 mg/kg), um die postoperativen Schmerzen zu lindern. Setzen Sie die Mäuse zurück in den Käfig und setzen Sie sie in eine Wärmedecke um, um ihre Genesung zu erleichtern. Bringen Sie die Mäuse dann in das Versuchstierhaus, nachdem sie sich frei bewegen können.HINWEIS: Um eine Beschädigung der Grundplatte durch Kämpfe zu vermeiden, können Mäuse, die sich der Operation unterzogen haben, einzeln oder mit einer minimalen Anzahl von Mitbewohnern untergebracht werden. Wir empfehlen, nach der Operation nicht mehr als drei Mäuse in einem Käfig zu halten. Desinfizieren Sie die Arbeitsflächen mit einer 10%igen Bleichlösung. Entfernen Sie die persönliche Einwegschutzausrüstung (PSA) und entsorgen Sie sie in Beuteln für biologische Gefahren. Überwachen Sie die Mäuse täglich für 3 Tage nach der Operation. Erfassen Sie das Körpergewicht von Mäusen und beobachten Sie ihren Wundheilungsstatus und ihre Fortbewegungsaktivitäten. Führen Sie 3 Tage lang täglich intraperitoneale Injektionen von Dexamethason- und Carprofen-Lösungen (die gleiche Dosierung wie in Schritt 2.13) durch. Stellen Sie bei Bedarf feuchtes Futter oder eine Behandlung bereit, um die Genesung zu erleichtern. 3. Überprüfen Sie die Qualität des Bildfeldes HINWEIS: Die Maus erholt sich 2-3 Wochen nach der Operation vor der ersten In-vivo-Kalziumbildgebung . Der Zweck dieses Schritts besteht darin, die Qualität der Operation und die Genesung der Maus zu überprüfen. Wenn im Bildgebungsfeld Einzelzellaktivität beobachtet werden kann und die Maus in gutem Zustand ist, befestigen Sie die Basisplatte am Schädel der Maus. Die Maus sollte durch Zervixluxation eingeschläfert werden, wenn die Bildqualität oder der Gesundheitszustand nicht ausreichend sind. Verbinden Sie die miniscope Datenerfassungsbox mit einem USB 3.0-Kabel mit dem Computer. Verbinden Sie dann das Koaxialkabel über den To Scope Anschluss (SMA) mit der Box. Schalten Sie die Miniskop-Steuerungssoftware ein. Klicken Sie in der Software auf Konfigurationsdatei auswählen | User Configuration Files V4 plus zum Betrachten der Live-Bilder. Verwenden Sie eine benutzerdefinierte Halterung, um die Maus auf dem Laufrad zu halten, indem Sie die Kopfplatte festklemmen. Halten Sie das Miniskop mit dem Miniskop-Halter (hergestellt im 3D-Druck; siehe Zusatzdatei 3 für die Konstruktion) und verwenden Sie ein stereotaktisches Instrument, um das Miniskop über den Kopf der Maus zu bewegen (Abbildung 4E). Entfernen Sie die Kappe mit einem Schraubendreher. Wischen Sie die Oberfläche der GRIN-Linse vorsichtig mit 75% Ethanol ab. Positionieren Sie das Miniskop knapp über der belichteten GRIN-Linse und stellen Sie die Unterseite des Zielfernrohrs parallel zur Oberfläche des Objektivs her. Finden Sie die beste Fokusebene, indem Sie das Miniskop langsam in Richtung des GRIN-Objektivs nach unten bringen.HINWEIS: Stellen Sie die Fokusebene auf 0 ein und passen Sie dann die Position des Miniskops an. Dies bietet mehr Spielraum, um den Fokus einzustellen. Wählen Sie die Fokusebene mit einer klaren Visualisierung der größten Anzahl von Zellen aus. Stellen Sie in der Miniskop-Steuerungssoftware die Leistung des LED-Lichts auf das optimale Niveau ein.HINWEIS: Um die Aktivität einzelner Zellen zu beobachten, sollte das Bildgebungsfeld weder überbelichtet noch zu dunkel sein. Die LED-Intensität liegt in der Regel innerhalb von 10 %. Wenn der vaskuläre Blutfluss sichtbar ist und die Zellen zahlreich und gleichmäßig über das Bildgebungsfeld verteilt sind, fahren Sie mit dem nächsten Abschnitt des Experiments fort.HINWEIS: In diesem Schritt ist es wichtig, die Aktivität einzelner Zellen beobachten zu können. Dies kann die Ergebnisse der Datenanalyse beeinflussen. Normalerweise sind regionale Aktivitäten (Klumpen von fluoreszierenden Fluktuationen) schwer zu interpretieren. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Zielneuronen unscharf von der GRIN-Linse sind. Die Maus wird in den nachfolgenden Experimenten nicht verwendet, wenn sich herausstellt, dass das Bildgebungsfeld schwarz ist, die Zellen regionale Aktivität aufweisen oder die Anzahl der Zellen unzureichend ist. Trennen Sie das Kabel vom Miniskop. 4. Befestigen Sie die Miniskop-Grundplatte am Mäuseschädel Befestigen Sie die Grundplatte am Miniskop und stellen Sie die Positionen des Miniskops neu ein, um ein Sichtfeld mit guter Bildqualität zu erhalten. Mischen Sie die Prothesengrundmaterialien in der Rührschüssel.HINWEIS: Wichtig ist, dass das Gemisch weder zu frei noch zu fest fließt. Zu viel Fließfähigkeit neigt dazu, die Oberfläche des GRIN-Objektivs zu bedecken, was zum Verlust des Bildfeldes führt. Wenn sie zu fest sind, können die Prothesengrundmaterialien den Spalt zwischen der Basisplatte und der Kopfplatte nicht dicht abdecken. Achten Sie darauf, die Position des Miniskops nicht zu verändern, während Sie die erste Schicht der Prothesenbasismaterialien vorsichtig um die Miniskop-Basisplatte herum auftragen. Warten Sie, bis die erste Zementschicht ausgehärtet ist, bevor Sie eine zweite Zementschicht von der Grundplatte auf die Kopfplatte auftragen. Lösen Sie nach dem Aushärten aller Prothesengrundmaterialien die Stellschraube und lösen Sie das Miniskop von der Basisplatte.HINWEIS: Achten Sie bei der Verwendung von Prothesenbasismaterialien auf das Bildgebungsfeld in der Software und nehmen Sie alle erforderlichen Anpassungen vor, bevor der Zement erstarrt. Entfernen Sie vorsichtig den Haltearm vom Miniskop. Setzen Sie die Kappe der Grundplatte in die Grundplatte ein, um die freiliegende GRIN-Linse zu schützen, und ziehen Sie die Stellschraube fest (Abbildung 4F). Setzen Sie die Maus wieder in ihren Heimatkäfig ein. Geben Sie der Maus einige Tage Zeit, sich zu erholen, bevor Sie die Verhaltensexperimente durchführen. 5. Datenerfassung HINWEIS: Die In-vivo-Calcium-Bildgebung kann gleichzeitig mit allen Verhaltenstests durchgeführt werden. In diesem Protokoll verwenden wir die lineare Spur als Beispiel. Diese lineare Schiene ist 1,5 m lang und hat an beiden Enden Wasser, das als Belohnung für die Mäuse dient. Die Mäuse können ein Miniaturmikroskop (Miniskop) tragen und für eine Dauer von 20 Minuten auf der Bahn hin und her laufen. Während dieser Zeit sind die Mäuse in der Regel in der Lage, ~60 Versuche durchzuführen. Verbinden Sie die miniscope Datenerfassungsbox mit einem USB 3.0-Kabel mit dem Computer. Verbinden Sie dann das Koaxialkabel über den To Scope (SMA)-Anschluss mit der Box. Schalten Sie die Miniskop-Steuerungssoftware ein. Klicken Sie in der Miniscope-Steuerungssoftware auf Konfigurationsdatei auswählen | User Configuration Files V4 plus zum Betrachten der Live-Bilder. Verbinden Sie die Industriekamera mit einem USB 3.0-Kabel mit dem Computer. Schalten Sie die Kamerasteuerungssoftware ein. Klicken Sie in der Software auf “Gerät öffnen” und wählen Sie die Datei aus, in die die Datenerfassungsparameter importiert werden sollen. Wählen Sie das Videoformat als Unkomprimiertes Video im AVI-Container aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um die Live-Bilder anzuzeigen.HINWEIS: Um die Dateigröße des verhaltensbasierten Aufnahmevideos zu verringern, sollte das Sichtfeld alle unnötigen Bereiche außerhalb der Spur ausschließen. Verwenden Sie eine benutzerdefinierte Halterung, um die Maus auf dem Laufrad zu halten, indem Sie die Kopfplatte festklemmen. Lösen Sie die Stellschraube mit einem Schraubendreher, entfernen Sie die Grundplattenkappe und reinigen Sie die Oberfläche der GRIN-Linse mit 75 % Ethanol. Montieren Sie das Miniskop an seiner Basis. Befestigen Sie das Miniskop an seiner Basis am Kopf der Maus. Finden Sie die beste Fokusebene, indem Sie die Taste für die Fokusebene verschieben. Bewegen Sie die Maus vorsichtig vom Laufrad auf die lineare Spur. Klicken Sie auf die Aufnahmetaste und halten Sie sie gedrückt, um die Aufnahme mit dem Miniskop zu starten. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Sammeln starten , um die Kameraaufnahme zu starten. Aufnahme für 20 min. Speichern Sie In-vivo-Calcium-Imaging-Daten, Verhaltensdaten und Arduino-Daten separat. Benennen Sie diese Dateien mit Datum, Sitzungsnummer und Mausnummer.HINWEIS: Studien, in denen ein Miniskop verwendet wird, haben in der Regel einen langfristigen Zeitraum für die Datenerfassung an einem einzelnen Versuchstier. Eine klare Benennung der Dateien kann bei der Datenverarbeitung hilfreich sein. Nehmen Sie das Miniskop von seiner Basis ab. Schließen Sie die Kamerasteuerungssoftware, die Miniskop-Steuerungssoftware und den Computer. Trennen Sie das Koaxialkabel vom To Scope (SMA) und das USB 3.0-Kabel von der Kamera. Lösen Sie die Stellschraube im Sockel, setzen Sie die Kappe der Grundplatte wieder auf und ziehen Sie die Schraube fest. Setzen Sie die Maus wieder in ihren Heimatkäfig ein. 6. Datenverarbeitung Laden Sie die aufgezeichneten Calcium-Imaging-Daten in MATLAB.HINWEIS: Wir sind uns bewusst, dass die Analyse der Daten auf das Versuchsdesign zugeschnitten sein sollte. Hier stellen wir eine Preprocessing-Pipeline zur Verfügung, die das Roh-Calcium-Imaging-Video in Aktivitätsspuren von einzelnen Zellen umwandelt. Wir glauben, dass dieses Verfahren relativ universell und nützlich für die Benutzer ist. Alle in diesem Abschnitt beschriebenen Skripte finden Sie in der Zusatzdatei 4. Konvertieren Sie die Bilddaten vom AVI-Format in das HDF5-Format (.h5).HINWEIS: Die Rohausgabe des Miniskops erzeugt AVI-Dateien mit Komprimierung. Die unkomprimierten Dateien sind in der Regel mehrere zehn Gigabyte groß. Das HDF5-Dateiformat ermöglicht einen virtuellen und teilweisen Zugriff, der für die spätere Analyse leicht visualisiert und manipuliert werden kann. Wenden Sie die nicht starre Bewegungskorrektur (NoRMCorre)19 an. Führen Sie ein Downsampling des bewegungskorrigierten Films durch, falls der Arbeitsspeicher des Computers für spätere Schritte begrenzt ist.HINWEIS: Die von miniscope erfassten Originaldaten haben eine Größe von 600 x 600. Durch die Verwendung eines räumlichen Downsamples können wir die Videogröße auf 200 x 200 reduzieren. Diese Methode senkt den Bedarf an Datenspeicherung erheblich und ermöglicht eine schnellere Datenverarbeitung. Wenden Sie EXTRACT auf die heruntergesampelten Daten an, um Einzelzellsignale zu identifizieren, indem Sie den Anweisungen für den EXTRACT-Code im Online-Repository20 (https://github.com/schnitzer-lab/EXTRACT-public) folgen.

Representative Results

Abbildung 1 zeigt das Schema des experimentellen Ablaufs, einschließlich der Virusinjektion, der Implantation der GRIN-Linse, der Befestigung der Basisplatte, der in vivo Calcium-Bildgebung über ein Miniskop und der Datenverarbeitung. In der Regel dauert der gesamte Eingriff 1 Monat. Abbildung 2 zeigt beispielhafte Verfahren der Virusinjektion, einschließlich der Positionierung des Bohrlochs auf dem Schädel und des Zustands des Hirngewebes vor der I…

Discussion

In dieser Arbeit wurde ein Verfahren zur in vivo Calcium-Bildgebung in der DG von Mäusen beschrieben. Wir glauben, dass dieses Protokoll für Forscher nützlich sein wird, die DG-Funktionen in verschiedenen kognitiven Prozessen untersuchen wollen, insbesondere in Fällen, in denen eine genetisch identifizierte Subpopulation von Interesse ist. Hier erläutern wir die Vorteile unseres Protokolls, betonen einige wichtige Punkte in der Chirurgie und diskutieren die Grenzen dieser Methode.

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird unterstützt durch das Shanghai Pilot Program for Basic Research – Fudan University 21TQ1400100 (22TQ019), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project, das Lingang Laboratory (Förder-Nr. LG-QS-202203-09) und National Natural Science Foundation of China (32371036).

Materials

200 μL universal pipette tips Transcat Pipettes 1030-260-000-9 For removing the blood and saline
25 G luer lock blunt needle (Prebent dispensing tips) iSmile 20-0105 For removing the brain tissue
3D printed protective cap N/A N/A To protect the GRIN Lens
75% ethanol Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd bwsj-230219105303 For disinfection and cleaning the GRIN lens surface
AAV2/9-CaMKIIα-GCaMP6f virus Brain Case BC-0083 For viral injection
Adobe Illustrator Adobe cc 2018 version 22.1 To draw figures
Anesthesia air pump RWD Life Science Co.,Ltd R510-30 For anesthesia
Camera control software Daheng Imaging Galaxy Windows SDK_CN (V2) For recording the behavioral data
Cannula/Ceramic Ferrule Holders (GRIN lens holder) RWD Life Science Co.,Ltd 68214 To hold the GRIN lens
Carprofen MedChemExpress 53716-49-7 To reduce postoperative pain of the mouse 
Coax Cable Open ephys CW8251 To connect the miniscope and the miniscope DAQ box
Confocal microscope Olympus Life Science  FV3000 For observing the brain slices
Cotton swab Nanchang Xiangyi Medical Devices Co.,Ltd 20202140438 For disinfection
Customized headplate N/A N/A For holding the mouse on the running wheel
Customized headplate holder N/A N/A To hold the headplate of the mouse
Denture base matierlals (self-curing) New Centry Dental 430205 For attaching the miniscope
Depilatory cream Veet ASIN : B001DUUPQ0 For removing the hair of the mouse
Desktop digital stereotaxic in strument, SGL M RWD Life Science Co.,Ltd 68803 For viral injection and GRIN lens implantation
Dexamethasone Huachu Co., Ltd. N/A To prevent postoperative inflammation of the mouse
Dissecting microscope RWD Life Science Co., Ltd MZ62-WX For observing the conditions during surgeries
Gas filter canister, large, packge of 6 RWD Life Science Co.,Ltd R510-31-6 For anesthesia
GRIN lens GoFoton CLHS100GFT003 For GRIN lens implantation
GRIN lens InFocus Grin Corp SIH-100-043-550-0D0-NC For GRIN lens implantation
Induction chamber-mouse (15 cm x 10 cm x 10 cm) RWD Life Science Co.,Ltd V100 For anesthesia
Industrial camera Daheng Imaging MER-231-41U3M-L, VS-0618H1 For acquiring the behavioral data
Iodophor disinfectant Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co.,Ltd 8861F6DFC92A For disinfection
Isoflurane RWD Life Science Co.,Ltd R510-22-10 For anesthesia
Liquid sample collection tube (Glass Capillaries micropipette for Nanoject III) Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X For viral injection
MATLAB MathWorks R2021b For analyzing the data
Microdrill RWD Life Science Co.,Ltd 78001 For craniotomy
Micropipette puller Narishige International USA PC-100 For pulling the liquid sample collection tube
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410 For viral injection
Miniscope DAQ Software Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software) N/A For recording the calcium imaging data
Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3) Open ephys V3.3 To acquire the calcium imaging data
Miniscope V4 Open ephys V4 For in vivo calcium imaging
Miniscope V4 base plate (Variant 2) Open ephys Variant 2 For holding the miniscope
nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific Company 3-000-207 For viral injection
Ophthalmic ointment Cisen Pharmaceutical Co.,Ltd. H37022025 To keep the eyes moist
PCR tube LabServ 309101009 For dilue the virus
Personal Computer (ThinkPad) Lenovo 20W0-005UCD To record the calcium imaging data and behavioral data
Running wheel Shanghai Edai Pet Products Co.,Ltd NA-H115 For holding the mouse when affixing the base plate
Screwdriver (M1.6 screws) Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) 60902 To unscrew the M1.6 screws
Screwdriver (set screws) Greenery (Yantai Greenery Tools Co.,Ltd) S2 For unscrew the set screws
Set screw TBD 2-56 cone point set screw For fasten the miniscope to its base plate
Small animal anesthesia machine RWD Life Science Co.,Ltd R500 For anesthesia
Sterile syringe Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD 20163140236 For rinse the blood
Surgical scissors RWD Life Science Co.,Ltd S14016-13 For cutting off the hair and scalp
ThermoStar temperature controller,69025 pad incl. RWD Life Science Co.,Ltd 69027 To maintain the animal's body temperature
Ultra fine forceps RWD Life Science Co.,Ltd F11020-11 For removing the bone debris and dura
USB 3.0 cable Open ephys N/A To connect the miniscope DAQ box and the computer
UV light Jinshida 66105854002 To fix the GRIN lens on the skull
UV resin (light cure adhesive) Loctite 32268 To fix the GRIN lens on the skull
Vacuum pump Kylin-Bell GL-802B To remove the blood, saline and the brain tissue

Referenzen

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Diesen Artikel zitieren
Han, S., Ding, N., Li, C., Yuan, P. In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice . J. Vis. Exp. (210), e66916, doi:10.3791/66916 (2024).

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