Imagerie calcique in vivo de cellules granulaires dans le gyrus denté de l’hippocampe chez la souris

Des études antérieures ont montré que l’hippocampe est une structure cérébrale essentielle au traitement et à la récupération des^souvenirs1,2. Depuis les années 1950, les circuits neuronaux de l’hippocampe chez les rongeurs ont été au centre de l’étude de la formation, du stockage et de la récupération de la mémoire³. Les structures anatomiques de l’hippocampe comprennent les sous-régions du gyrus denté (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 et du subiculum⁴. Des connexions bidirectionnelles complexes existent entre ces sous-régions, dont la DG, CA1 et CA3 forment un circuit trisynaptique proéminent composé de cellules granulaires et de cellules pyramidales⁵. Ce circuit reçoit son entrée primaire du cortex entorhinal (CE) et a été un modèle classique pour l’étude de la plasticité synaptique. Les recherches in vivo antérieures sur la fonction de l’hippocampe se sont principalement concentrées sur le CA1 ^6,7 en raison de son accès plus facile. Alors que les neurones CA1 jouent un rôle important dans la formation, la consolidation et la récupération de la mémoire, en particulier dans les cellules de place pour la mémoire spatiale, d’autres sous-régions de l’hippocampe sont également vitales ^8,9. En particulier, des études récentes ont mis en évidence les fonctions de la DG dans la formation de la mémoire. Les cellules de lieu dans la MD sont plus stables que celles de CA1¹⁰, et leurs activités reflètent des informations spécifiques au contexte¹¹. De plus, le marquage dépendant de l’activité des cellules granulaires DG peut être réactivé pour induire des comportements liés à la mémoire¹². Par conséquent, pour mieux comprendre le codage de l’information dans la DG, il est crucial d’étudier les activités de la sous-région de la MD pendant que l’animal effectue des tâches dépendantes de la mémoire.

Les études antérieures sur les activités des DG ont principalement utilisé l’électrophysiologie in vivo ¹³. Cependant, cette technique présente quelques inconvénients : tout d’abord, dans les enregistrements électriques, il peut être difficile d’identifier directement les différents types de cellules qui génèrent le signal. Les signaux enregistrés proviennent à la fois de cellules inhibitrices et de cellules excitatrices. Par conséquent, d’autres méthodes de traitement des données sont nécessaires pour séparer ces deux types de cellules. De plus, il est difficile de combiner d’autres informations sur le type de cellule, telles que des sous-groupes spécifiques à la projection ou un étiquetage dépendant de l’activité, avec des enregistrements électriques. De plus, en raison de la morphologie anatomique de la DG, les électrodes d’enregistrement sont souvent implantées dans une direction orthogonale, ce qui limite considérablement le nombre de neurones pouvant être enregistrés. Ainsi, il est difficile pour les enregistrements électriques de surveiller des centaines de neurones individuels de la structure DG chez le même animal¹⁴.

Une technique complémentaire d’enregistrement des activités neuronales dans la DG consiste à utiliser l’imagerie calcique in vivo ¹⁵. Les ions calcium sont fondamentaux dans les processus de signalisation cellulaire des organismes, jouant un rôle crucial dans de nombreuses fonctions physiologiques, en particulier dans le système nerveux des mammifères. Lorsque les neurones sont actifs, la concentration intracellulaire de calcium augmente rapidement, ce qui reflète la nature dynamique de l’activité neuronale et de la transmission du signal. Par conséquent, l’enregistrement en temps réel des changements dans les niveaux de calcium intracellulaire dans les neurones fournit des informations importantes sur les mécanismes de codage neuronaux.

La technologie d’imagerie calcique utilise des colorants fluorescents spécialisés ou des indicateurs calciques génétiquement modifiés (GECI) pour surveiller les concentrations d’ions calcium dans les neurones en détectant les changements d’intensité de fluorescence, qui peuvent ensuite être capturés par imagerie microscopique¹⁶. Généralement, la famille GCaMP de gènes indicateurs de calcium, comprenant la protéine fluorescente verte (GFP), la calmoduline et les séquences polypeptidiques M13, est utilisée. GCaMP peut émettre une fluorescence verte lorsqu’il se lie aux ions calcium¹⁷, ce qui permet d’enregistrer les fluctuations de la fluorescence verte par imagerie¹⁸. De plus, pour obtenir des images claires de la région cérébrale cible, une lentille à gradient d’indice (lentille GRIN) est généralement implantée au-dessus de la région d’intérêt. La lentille GRIN permet d’imager la région profonde du cerveau qui n’est pas accessible directement depuis la surface.

Cette technique est relativement facile à combiner avec d’autres outils génétiques pour marquer différents types de cellules. De plus, comme le plan d’imagerie est parallèle à l’orientation des cellules dans la DG, des centaines de neurones sont accessibles pour l’imagerie à chaque intervention chirurgicale réussie. Dans ce travail, nous présentons un protocole chirurgical complet et détaillé pour l’imagerie calcique in vivo dans le gyrus denté chez la souris (Figure 1). La procédure comporte deux opérations principales. La première consiste à injecter le virus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f dans la DG. La deuxième opération consiste à implanter une lentille GRIN au-dessus du site d’injection du virus. Ces deux procédures se déroulent au cours de la même séance. Après la récupération de ces chirurgies, l’étape suivante consiste à vérifier la qualité de l’imagerie avec des microscopes miniaturisés (miniscopes). Si le champ d’imagerie comporte des centaines de cellules actives, la procédure ultérieure consiste à fixer la plaque de base du miniscope sur le crâne de la souris à l’aide de ciment dentaire ; La souris peut ensuite être utilisée pour des expériences d’imagerie. Nous présentons également un pipeline de prétraitement basé sur MATLAB pour rationaliser l’analyse des données de calcium collectées.