Imagem de cálcio in vivo de células granulares no giro dentado do hipocampo em camundongos

Estudos anteriores descobriram que o hipocampo é uma estrutura cerebral essencial para processar e recuperar memórias^. Desde a década de 1950, os circuitos neurais do hipocampo em roedores têm sido um foco no estudo da formação, armazenamento e recuperação da memória³. As estruturas anatômicas dentro do hipocampo incluem as sub-regiões do giro dentado (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 e subículo⁴. Existem conexões bidirecionais complexas entre essas sub-regiões, das quais DG, CA1 e CA3 formam um circuito trissináptico proeminente que consiste em células granulares e células piramidais⁵. Este circuito recebe sua entrada primária do córtex entorrinal (EC) e tem sido um modelo clássico para estudar a plasticidade sináptica. Pesquisas anteriores in vivo sobre a função do hipocampo se concentraram principalmente no CA1 ^6,7 devido ao seu acesso mais fácil. Enquanto os neurônios CA1 desempenham papéis importantes na formação, consolidação e recuperação da memória, particularmente nas células locais para memória espacial, outras sub-regiões do hipocampo também são vitais ^8,9. Em particular, estudos recentes destacaram as funções do DG na formação da memória. As células de lugar no DG foram relatadas como mais estáveis do que as do CA1¹⁰, e suas atividades refletem informações específicas do contexto¹¹. Além disso, a marcação dependente da atividade das células granulares DG pode ser reativada para induzir comportamentos relacionados à memória¹². Portanto, para obter uma compreensão mais profunda da codificação de informações em DG, é crucial investigar as atividades da sub-região DG enquanto o animal está realizando tarefas dependentes de memória.

Estudos prévios sobre as atividades de GD utilizaram principalmente eletrofisiologia in vivo ¹³. No entanto, essa técnica tem algumas desvantagens: primeiro, em gravações elétricas, pode ser difícil identificar diretamente os vários tipos de células que estão gerando o sinal. Os sinais registrados são de células inibitórias e excitatórias. Portanto, outros métodos de processamento de dados são necessários para separar esses dois tipos de células. Além disso, é difícil combinar outras informações de tipo de célula, como subgrupos específicos de projeção ou rotulagem dependente de atividade, com gravações elétricas. Além disso, devido à morfologia anatômica do DG, os eletrodos de registro são frequentemente implantados em uma direção ortogonal, o que limita muito o número de neurônios que podem ser registrados. Assim, é difícil para as gravações elétricas conseguirem monitorar centenas de neurônios individuais da estrutura DG no mesmo animal¹⁴.

Uma técnica complementar de registro das atividades dos neurônios no GD é usar imagens de cálcio in vivo ¹⁵. Os íons de cálcio são fundamentais para os processos de sinalização celular nos organismos, desempenhando um papel crucial em muitas funções fisiológicas, especialmente no sistema nervoso dos mamíferos. Quando os neurônios estão ativos, a concentração de cálcio intracelular aumenta rapidamente, refletindo a natureza dinâmica da atividade neuronal e da transmissão do sinal. Portanto, registrar as mudanças em tempo real nos níveis de cálcio intracelular nos neurônios fornece informações importantes sobre os mecanismos de codificação neural.

A tecnologia de imagem de cálcio utiliza corantes fluorescentes especializados ou indicadores de cálcio geneticamente modificados (GECIs) para monitorar as concentrações de íons de cálcio nos neurônios, detectando mudanças na intensidade da fluorescência, que podem ser capturadas por meio de imagens microscópicas¹⁶. Comumente, a família GCaMP de genes indicadores de cálcio, compreendendo proteínas fluorescentes verdes (GFP), calmodulina e sequências polipeptídicas M13, é empregada. O GCaMP pode emitir fluorescência verde quando se liga a íons de cálcio¹⁷, permitindo que as flutuações na fluorescência verde sejam registradas por meio de imagens¹⁸. Além disso, para obter imagens nítidas da região alvo do cérebro, uma lente de índice gradiente (lente GRIN) é normalmente implantada acima da região de interesse. A lente GRIN permite a aquisição de imagens da região profunda do cérebro que não pode ser acessada diretamente da superfície.

Essa técnica é relativamente fácil de combinar com outras ferramentas genéticas para rotular diferentes tipos de células. Além disso, como o plano de imagem é paralelo à orientação das células no DG, centenas de neurônios são acessíveis para imagens a cada cirurgia bem-sucedida. Neste trabalho, apresentamos um protocolo cirúrgico completo e detalhado para imagens de cálcio in vivo no giro dentado em camundongos (Figura 1). O procedimento envolve duas operações principais. A primeira é injetar o vírus AAV-CaMKIIα-GCaMP6f no DG. A segunda operação é implantar uma lente GRIN acima do local da injeção do vírus. Estes dois procedimentos são conduzidos na mesma sessão. Após a recuperação dessas cirurgias, o próximo passo é verificar a qualidade da imagem com microscópios miniaturizados (miniscópios). Se o campo de imagem tiver centenas de células ativas, o procedimento subsequente é anexar a placa de base do miniscópio ao crânio do camundongo usando cimento dentário; O mouse pode então ser usado para experimentos de imagem. Também apresentamos um pipeline de pré-processamento baseado em MATLAB para agilizar a análise dos dados de cálcio coletados.