In vivo Calcium-Bildgebung von Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus bei Mäusen

Frühere Studien haben gezeigt, dass der Hippocampus eine Gehirnstruktur ist, die für die Verarbeitung und den Abruf von Erinnerungen unerlässlich ist ^1,2. Seit den 1950er Jahren stehen die neuronalen Schaltkreise des Hippocampus bei Nagetieren im Mittelpunkt der Erforschung der Gedächtnisbildung, -speicherung und -abfrage³. Zu den anatomischen Strukturen innerhalb des Hippocampus gehören die Subregionen Gyrus dentatus (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 und Subiculum⁴. Zwischen diesen Subregionen bestehen komplexe bidirektionale Verbindungen, von denen DG, CA1 und CA3 einen prominenten trisynaptischen Schaltkreis bilden, der aus Körnerzellen und Pyramidenzellen^{besteht 5}. Dieser Schaltkreis erhält seinen primären Input vom entorhinalen Kortex (EC) und ist ein klassisches Modell für die Untersuchung der synaptischen Plastizität. Frühere in vivo-Forschungen zur Funktion des Hippocampus konzentrierten sich aufgrund des leichteren Zugangs hauptsächlich auf das CA1 ^6,7. Während CA1-Neuronen eine wichtige Rolle bei der Gedächtnisbildung, -konsolidierung und -abfrage spielen, insbesondere in Ortszellen für das räumliche Gedächtnis, sind auch andere Subregionen des Hippocampus von entscheidender Bedeutung ^8,9. Neuere Studien haben insbesondere die Funktionen von DG bei der Gedächtnisbildung hervorgehoben. Es wurde berichtet, dass Ortszellen in DG stabiler sind als solche in CA1¹⁰, und ihre Aktivitäten spiegeln kontextspezifische Informationen^{wider 11}. Darüber hinaus kann die aktivitätsabhängige Markierung von DG-Körnerzellen reaktiviert werden, um gedächtnisbezogene Verhaltensweisen zu induzieren¹². Um ein tieferes Verständnis der Informationskodierung in DG zu erlangen, ist es daher von entscheidender Bedeutung, die Aktivitäten der DG-Subregion zu untersuchen, während das Tier gedächtnisabhängige Aufgaben ausführt.

Frühere Studien zu den Tätigkeiten der GD haben sich hauptsächlich auf die In-vivo-Elektrophysiologie gestützt¹³. Diese Technik hat jedoch einige Nachteile: Erstens kann es bei elektrischen Aufzeichnungen schwierig sein, die verschiedenen Zelltypen, die das Signal erzeugen, direkt zu identifizieren. Die aufgezeichneten Signale stammen sowohl von inhibitorischen als auch von exzitatorischen Zellen. Daher sind weitere Datenverarbeitungsmethoden erforderlich, um diese beiden Zelltypen zu trennen. Darüber hinaus ist es schwierig, andere Zelltypinformationen, wie z.B. projektionsspezifische Untergruppen oder aktivitätsabhängige Markierungen, mit elektrischen Aufzeichnungen zu kombinieren. Darüber hinaus werden die Aufzeichnungselektroden aufgrund der anatomischen Morphologie von DG oft in orthogonaler Richtung implantiert, was die Anzahl der Neuronen, die aufgezeichnet werden können, stark einschränkt. Daher ist es für elektrische Aufzeichnungen schwierig, Hunderte von einzelnen Neuronen aus der DG-Struktur im selben Tier^{zu überwachen 14}.

Eine ergänzende Technik zur Aufzeichnung von Neuronenaktivitäten bei DG ist die Verwendung von In-vivo-Calcium-Bildgebung ¹⁵. Kalziumionen sind grundlegend für zelluläre Signalprozesse in Organismen und spielen eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen Funktionen, insbesondere im Nervensystem von Säugetieren. Wenn Neuronen aktiv sind, steigt die intrazelluläre Kalziumkonzentration schnell an, was die dynamische Natur der neuronalen Aktivität und Signalübertragung widerspiegelt. Daher liefert die Aufzeichnung der Echtzeit-Veränderungen des intrazellulären Kalziumspiegels in Neuronen wichtige Einblicke in die neuronalen Kodierungsmechanismen.

Die Calcium-Imaging-Technologie verwendet spezielle Fluoreszenzfarbstoffe oder gentechnisch hergestellte Calcium-Indikatoren (GECIs), um die Calciumionenkonzentrationen in Neuronen zu überwachen, indem Änderungen der Fluoreszenzintensität erkannt werden, die dann durch mikroskopische Bildgebung erfasst werden können¹⁶. Üblicherweise wird die GCaMP-Familie von Kalziumindikatorgenen verwendet, die grün fluoreszierendes Protein (GFP), Calmodulin und M13-Polypeptidsequenzen umfasst. GCaMP kann grüne Fluoreszenz emittieren, wenn es an Kalziumionen^{bindet 17}, so dass die Fluktuationen der grünen Fluoreszenz mittels Bildgebung^{aufgezeichnet werden können 18}. Um klare Bilder der Zielregion des Gehirns zu erhalten, wird in der Regel eine Gradientenindexlinse (GRIN-Linse) über der interessierenden Region implantiert. Die GRIN-Linse ermöglicht die Bildgebung der tiefen Hirnregion, die von der Oberfläche aus nicht direkt zugänglich ist.

Diese Technik lässt sich relativ einfach mit anderen genetischen Werkzeugen kombinieren, um verschiedene Zelltypen zu markieren. Da die Bildgebungsebene parallel zur Orientierung der Zellen in DG verläuft, sind bei jeder erfolgreichen Operation Hunderte von Neuronen für die Bildgebung zugänglich. In dieser Arbeit stellen wir ein vollständiges und detailliertes Operationsprotokoll für die in vivo Calciumbildgebung im Gyrus dentatus bei Mäusen vor (Abbildung 1). Das Verfahren umfasst zwei große Operationen. Die erste besteht darin, das AAV-CaMKIIα-GCaMP6f-Virus in die DG zu injizieren. Die zweite Operation besteht darin, eine GRIN-Linse über der Virusinjektionsstelle zu implantieren. Diese beiden Verfahren werden in derselben Sitzung durchgeführt. Nach der Genesung von diesen Operationen erfolgt im nächsten Schritt die Überprüfung der Bildqualität mit miniaturisierten Mikroskopen (Miniskopen). Wenn das Bildgebungsfeld Hunderte von aktiven Zellen aufweist, besteht das anschließende Verfahren darin, die Basisplatte des Miniskops mit Zahnzement auf dem Schädel der Maus zu befestigen. Die Maus kann dann für bildgebende Experimente verwendet werden. Wir stellen auch eine MATLAB-basierte Preprocessing-Pipeline vor, um die Analyse der gesammelten Kalziumdaten zu rationalisieren.