小鼠海马齿状回管颗粒细胞的体内钙成像

以前的研究发现，海马体是处理和检索记忆所必需的大脑结构 ^1,2。自 1950 年代以来，啮齿动物海马体的神经回路一直是研究记忆形成、存储和检索的重点³。海马内的解剖结构包括齿状回 （DG）、CA1、CA2、CA3、CA4 和亚眼⁴ 的亚区。这些亚区之间存在复杂的双向连接，其中 DG、CA1 和 CA3 形成一个突出的三突触环，由颗粒细胞和锥体细胞组成⁵。该回路从内嗅皮层 （EC） 接收其主要输入，一直是研究突触可塑性的经典模型。先前关于海马功能的体内研究主要集中在 CA1 ^6,7 上，因为它更容易接近。虽然 CA1 神经元在记忆形成、巩固和检索中起着重要作用，特别是在空间记忆的原位细胞中，但海马体的其他亚区域也至关重要 ^8,9。特别是，最近的研究强调了 DG 在记忆形成中的作用。据报道，DG 中的位置细胞比 CA1 中的细胞更稳定¹⁰，并且它们的活性反映了特定环境的信息¹¹。此外，DG 颗粒细胞的活性依赖性标记可以被重新激活以诱导记忆相关行为¹²。因此，为了更深入地理解 DG 中的信息编码，在动物执行记忆依赖任务时研究 DG 子区域的活动至关重要。

DG 活性的先前研究主要使用 体内 电生理学¹³。然而，这种技术也有一些缺点：首先，在电记录中，可能很难直接识别产生信号的各种类型的细胞。记录的信号来自抑制性和兴奋性细胞。因此，需要进一步的数据处理方法来分离这两种细胞类型。此外，很难将其他细胞类型信息（例如投影特异性亚组或活性依赖性标记）与电记录相结合。此外，由于 DG 的解剖形态，记录电极通常以正交方向植入，这极大地限制了可以记录的神经元数量。因此，电记录很难实现对同一动物 DG 结构中数百个单个神经元的监测¹⁴。

在 DG 中记录神经元活动的补充技术是使用 体内钙成像 ¹⁵。钙离子是生物体细胞信号传导过程的基础，在许多生理功能中起着至关重要的作用，尤其是在哺乳动物神经系统中。当神经元活跃时，细胞内钙浓度迅速增加，反映了神经元活动和信号传递的动态性质。因此，记录神经元细胞内钙水平的实时变化为了解神经编码机制提供了重要的见解。

钙成像技术利用专门的荧光染料或基因工程钙指示剂 （GECI） 通过检测荧光强度的变化来监测神经元中的钙离子浓度，然后通过显微成像捕获这些变化¹⁶。通常，采用钙指示基因的 GCaMP 家族，包括绿色荧光蛋白 （GFP）、钙调蛋白和 M13 多肽序列。GCaMP 与钙离子结合时可发出绿色荧光¹⁷，从而可通过成像记录绿色荧光的波动¹⁸。此外，为了获得目标大脑区域的清晰图像，通常在感兴趣区域上方植入梯度折射率透镜（GRIN 透镜）。GRIN 镜头能够对无法直接从表面进入的大脑深部区域进行成像。

该技术相对容易与其他遗传工具结合使用来标记不同的细胞类型。此外，由于成像平面与 DG 中细胞的方向平行，因此每次成功的手术都可以访问数百个神经元进行成像。在这项工作中，我们提出了一个完整而详细的手术方案，用于小鼠齿状回的 体内 钙成像（图 1）。该程序涉及两个主要操作。第一种是将 AAV-CaMKIIα-GCaMP6f 病毒注射到 DG 中。第二种操作是在病毒注射部位上方植入 GRIN 晶状体。这两个程序在同一次会议上进行。从这些手术中恢复后，下一步是使用小型显微镜（微型显微镜）检查成像质量。如果成像区域有数百个活性细胞，则后续程序是使用牙科水泥将微型望远镜底板附着在小鼠头骨上;然后，鼠标可用于成像实验。我们还提出了一个基于 MATLAB 的预处理管道，用于简化对收集的钙数据的分析。