Exame de piroptose por citometria de fluxo
Summary
Este artigo descreve a identificação de células piroptóticas usando citometria de fluxo após coloração dupla com anticorpos contra o fragmento N-terminal de GSDME de frango (chGSDME-NT) e iodeto de propídio (PI).
Abstract
A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada predominantemente impulsionada pela formação de poros da membrana plasmática pelo terminal N gerado a partir das proteínas da família Gasdermin clivada (GSDM). O exame de GSDM-NT ligado à membrana por Western Blot é o método mais comumente usado para avaliar a piroptose. No entanto, é difícil diferenciar células com piroptose de outras formas de morte celular usando este método. Neste estudo, células DF-1 infectadas pelo Vírus da Doença Infecciosa da Bursa (IBDV) foram empregadas como modelo para quantificar a proporção de células submetidas à piroptose por citometria de fluxo, utilizando anticorpos específicos contra o fragmento N-terminal da coloração GSDME de galinha (chGSDME-NT) e iodeto de propídio (PI). As células chGSDME-NT-positivas foram prontamente detectáveis por citometria de fluxo usando anticorpos anti-chGSDME-NT marcados com Alexa Fluor 647. Além disso, a proporção de células chGSDME-NT / PI duplamente positivas em células infectadas por IBDV (cerca de 33%) foi significativamente maior do que em controles infectados simulados (P < 0,001). Esses achados indicam que o exame de chGSDME-NT ligado à membrana por citometria de fluxo é uma abordagem eficaz para determinar células piroptóticas entre células submetidas à morte celular.
Introduction
A piroptose é um tipo inflamatório de morte celular programada que depende principalmente da formação de poros da membrana plasmática pela Gasdermin (GSDM) D em mamíferos 1,2,3. Devido à deficiência genética de GSDMD em galinhas 4,5, o mecanismo de piroptose em galinhas permanece indefinido. A família Gasdermin compreende proteínas conservadas, incluindo GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME e DFNB59 3,6. Estudos relataram que o GSDME de peixes teleósteos e patos é clivado por caspase-1/3/7 ou caspase-3/7 para induzir a morte celular piroptótica 7,8. No entanto, o papel da piroptose mediada por GSDME na resposta do hospedeiro a infecções patogênicas em galinhas ainda precisa ser elucidado.
A doença infecciosa da bursa (DII) é uma doença avícola aguda, altamente contagiosa e imunossupressora causada pelo IBDV9. O IBDV, um vírus de RNA de fita dupla (ds) bissegmentado não envelopado, pertence ao gênero Avibirnavirus da família Birnaviridae10. Estudos anteriores de outros e de nosso laboratório mostraram que a infecção por IBDV induz a morte celular em células hospedeiras por diferentes vias 11,12,13,14. Achados anteriores demonstraram que a infecção por IBDV desencadeia a liberação de lactato desidrogenase (LDH), um indicador de morte celular lítica 6,15, sugerindo que a infecção por IBDV induz a morte celular lítica em células hospedeiras. Além disso, os dados mostram que as células infectadas por IBDV exibem características morfológicas de morte celular piroptótica, incluindo inchaço celular com grandes bolhas soprando da membrana plasmática e coloração de iodeto de propídio (PI) positiva, sugerindo que a infecção por IBDV induz piroptose nas células.
Considerando que a formação de poros de membrana em células piroptóticas pelo fragmento N-terminal de GSDM clivado (GSDM-NT) é uma marca registrada da piroptose, teoricamente, as células piroptóticas poderiam ser detectadas por citometria de fluxo examinando GSDM-NT na membrana celular usando anticorpos específicos. Em células piroptóticas aviárias, o fragmento N-terminal de galinha Gasdermin E (chGSDME-NT) forma poros de membrana, permitindo que o iodeto de propídio (PI) passe e se ligue ao DNA. Assim, a proporção de células piroptóticas pode ser detectada por citometria de fluxo, distinguindo assim a piroptose de outras formas de morte celular, como apoptose e necrose. No entanto, o método de exame de células piroptóticas por citometria de fluxo não foi relatado. Neste estudo, as células DF-1 foram infectadas com IBDV, e a citometria de fluxo foi realizada para examinar células piroptóticas usando anticorpos monoclonais (McAb) contra o fragmento chGSDME-NT (ligado à membrana) e coloração PI. Surpreendentemente, as células piroptóticas foram efetivamente detectadas por citometria de fluxo. Além disso, a proporção de células piroptóticas pode ser quantificada. Essas descobertas fornecem um meio poderoso e eficaz para determinar a piroptose.
Este artigo descreve um método para examinar a piroptose em células infectadas por IBDV por citometria de fluxo usando coloração anti-chGSDME-NT McAb e PI. Este método também pode ser estendido a outras células infectadas por patógenos e aplicado para examinar vários tipos de células com piroptose, distinguindo-as de outras formas de morte celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve um método eficaz para examinar a piroptose usando citometria de fluxo, obtida por meio da coloração dupla de células infectadas com Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT McAb e PI. Essa abordagem também pode ser aplicada em vários tipos de células para diferenciar a piroptose de outros tipos de morte celular, como apoptose e necrose.
A piroptose, um tipo inflamatório de morte celular programada dependente principalmente da formação de poros da membrana plasm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Jue Liu por sua gentil assistência. Este estudo foi apoiado por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (nº 2022YFD1800300), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32130105) e do Fundo Destinado ao Sistema de Pesquisa Tecnológica da Agroindústria Moderna (nº. CARS-40), China.
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
References
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