فحص البيروبتوسيس عن طريق قياس التدفق الخلوي
Summary
توضح هذه المقالة تحديد الخلايا البيروبوتية باستخدام قياس التدفق الخلوي بعد تلطيخ مزدوج بالأجسام المضادة ضد الجزء N-terminal من الدجاج GSDME (chGSDME-NT) ويوديد البروبيديوم (PI).
Abstract
Pyroptosis هو نوع التهابي من موت الخلايا المبرمج مدفوعا في الغالب بتكوين مسام غشاء البلازما بواسطة N-terminus المتولدة من بروتينات عائلة Gasdermin المشقوقة (GSDM). يعد فحص GSDM-NT المتصل بالغشاء بواسطة Western Blot هو الطريقة الأكثر استخداما لتقييم pyroptosis. ومع ذلك ، من الصعب التمييز بين الخلايا المصابة بالبيروبتوسيس والأشكال الأخرى لموت الخلايا باستخدام هذه الطريقة. في هذه الدراسة ، تم استخدام خلايا DF-1 المصابة بفيروس مرض الجراب المعدي (IBDV) كنموذج لتحديد نسبة الخلايا التي تخضع لداء البيروبتوسيس عن طريق قياس التدفق الخلوي ، باستخدام أجسام مضادة محددة ضد الجزء الطرفي N من الدجاج GSDME (chGSDME-NT) وتلطيخ يوديد البروبيديوم (PI). كانت الخلايا الإيجابية ل chGSDME-NT قابلة للاكتشاف بسهولة عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل chGSDME-NT التي تحمل علامة Alexa Fluor 647. علاوة على ذلك ، كانت نسبة الخلايا الإيجابية المزدوجة chGSDME-NT / PI في الخلايا المصابة بفيروس IBDV (حوالي 33٪) أكبر بكثير من الضوابط المصابة بالوهمية (P < 0.001). تشير هذه النتائج إلى أن فحص chGSDME-NT المرتبط بالغشاء عن طريق قياس التدفق الخلوي هو نهج فعال لتحديد الخلايا البيروبوتية بين الخلايا التي تمر بموت الخلايا.
Introduction
Pyroptosis هو نوع التهابي من موت الخلايا المبرمج الذي يعتمد بشكل أساسي على تكوين مسام غشاء البلازما بواسطة Gasdermin (GSDM) D في الثدييات1،2،3. بسبب النقص الوراثي في GSDMD في الدجاج 4,5 ، لا تزال آلية pyroptosis في الدجاج بعيدة المنال. تتكون عائلة Gasdermin من بروتينات محفوظة ، بما في ذلك GSDMA و GSDMB و GSDMC و GSDMD و GSDME و DFNB59 3,6. أفادت الدراسات أن GSDME من أسماك وبط teleost مشقوق بواسطة caspase-1/3/7 أو caspase-3/7 للحث على موت الخلايا البيروبوتية 7,8. ومع ذلك ، لا يزال يتعين توضيح دور داء البيروبتوسيس بوساطة GSDME في استجابة المضيف للعدوى المسببة للأمراض في الدجاج.
مرض الجراب المعدي (IBD) هو مرض دواجن حاد وشديد العدوى ومثبط للمناعة يسببه IBDV9. IBDV ، وهو فيروس RNA مزدوج المقطع ثنائي المقطع (ds) غير مغلف ، ينتمي إلى جنس Avibirnavirus في عائلة Birnaviridae10. أظهرت الدراسات السابقة التي أجراها آخرون ومختبرنا أن عدوى IBDV تحفز موت الخلايا في الخلايا المضيفة عبر مسارات مختلفة11،12،13،14. أظهرت النتائج السابقة أن عدوى IBDV تؤدي إلى إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) ، وهو مؤشر على موت الخلايا المحللة 6,15 ، مما يشير إلى أن عدوى IBDV تحفز موت الخلايا المحللة في الخلايا المضيفة. علاوة على ذلك ، تظهر البيانات أن الخلايا المصابة بفيروس IBDV تظهر سمات مورفولوجية لموت الخلايا البيروبوتية ، بما في ذلك تورم الخلايا مع فقاعات كبيرة تهب من غشاء البلازما وتلطيخ يوديد البروبيديوم (PI) الإيجابي ، مما يشير إلى أن عدوى IBDV تحفز pyroptosis في الخلايا.
بالنظر إلى أن تكوين مسام الغشاء في الخلايا البيروبوتية بواسطة الجزء N-terminal من GSDM المشقوق (GSDM-NT) هو السمة المميزة ل pyroptosis ، من الناحية النظرية ، يمكن اكتشاف الخلايا البيروبوتية عن طريق قياس التدفق الخلوي عن طريق فحص GSDM-NT على غشاء الخلية باستخدام أجسام مضادة محددة. في الخلايا البيروبوتية للطيور ، تشكل الجزء N-terminal من الدجاج Gasdermin E (chGSDME-NT) مسام غشائية ، مما يسمح ليوديد البروبيديوم (PI) بالمرور عبر الحمض النووي وربطه. وبالتالي ، يمكن الكشف عن نسبة الخلايا البيروبوتية باستخدام قياس التدفق الخلوي ، وبالتالي التمييز بين pyroptosis والأشكال الأخرى لموت الخلايا ، مثل موت الخلايا المبرمج والنخر. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن طريقة فحص الخلايا pyroptotic عن طريق قياس التدفق الخلوي. في هذه الدراسة ، أصيبت خلايا DF-1 بفيروس IBDV ، وتم إجراء قياس التدفق الخلوي لفحص الخلايا البيروبتونية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (McAb) ضد جزء chGSDME-NT (المرتبط بالغشاء) وتلطيخ PI. والمثير للدهشة أن الخلايا البيروبوتية تم اكتشافها بشكل فعال عن طريق قياس التدفق الخلوي. علاوة على ذلك ، يمكن تحديد نسبة الخلايا البيروبوتية. توفر هذه النتائج وسيلة قوية وفعالة لتحديد pyroptosis.
توضح هذه المقالة طريقة لفحص pyroptosis في الخلايا المصابة ب IBDV عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام تلطيخ MCAB و PI المضاد ل chGSDME-NT. يمكن أيضا توسيع هذه الطريقة لتشمل الخلايا الأخرى المصابة بمسببات الأمراض وتطبيقها لفحص أنواع مختلفة من الخلايا المصابة بالبيروبتوسيس ، وتمييزها عن الأشكال الأخرى لموت الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة طريقة فعالة لفحص pyroptosis باستخدام قياس التدفق الخلوي ، والذي يتحقق من خلال تلطيخ مزدوج للخلايا المصابة باستخدام Alexa Fluor 647 المسمى بمكافحة chGSDME-NT McAb و PI. يمكن أيضا تطبيق هذا النهج عبر أنواع مختلفة من الخلايا للتمييز بين داء البيروبتوسيس والأنواع الأخرى من موت الخلايا ، م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور جو ليو على مساعدته الكريمة. تم دعم هذه الدراسة بمنح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2022YFD1800300) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 32130105) ، والصندوق المخصص لنظام أبحاث تكنولوجيا الصناعة الزراعية الحديثة (No. CARS-40)، الصين.
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
References
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9 (2022).
- De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
- Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526 (2022).
- Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
- Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
- Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
- Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724-e01819 (2020).
- Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
- Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
- Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).
