Esame della piroptosi mediante citometria a flusso
Summary
Questo articolo descrive l’identificazione di cellule pirottiche mediante citometria a flusso dopo doppia colorazione con anticorpi contro il frammento N-terminale di GSDME di pollo (chGSDME-NT) e lo ioduro di propidio (PI).
Abstract
La piroptosi è un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata guidata prevalentemente dalla formazione di pori della membrana plasmatica da parte dell’N-terminale generato dalle proteine della famiglia Gasdermin (GSDM). L’esame del GSDM-NT attaccato alla membrana mediante Western Blot è il metodo più comunemente usato per valutare la piroptosi. Tuttavia, è difficile differenziare le cellule con piroptosi da altre forme di morte cellulare utilizzando questo metodo. In questo studio, le cellule DF-1 infettate dal virus della malattia infettiva della borsa (IBDV) sono state impiegate come modello per quantificare la percentuale di cellule sottoposte a piroptosi mediante citometria a flusso, utilizzando anticorpi specifici contro il frammento N-terminale del GSDME di pollo (chGSDME-NT) e la colorazione con ioduro di propidio (PI). Le cellule chGSDME-NT-positive erano facilmente rilevabili mediante citometria a flusso utilizzando gli anticorpi anti-chGSDME-NT marcati con Alexa Fluor 647. Inoltre, la percentuale di cellule double-positive chGSDME-NT/PI nelle cellule infettate da IBDV (circa il 33%) era significativamente maggiore rispetto ai controlli con mock-infected (P < 0,001). Questi risultati indicano che l'esame del chGSDME-NT legato alla membrana mediante citometria a flusso è un approccio efficace per determinare le cellule piroptotiche tra le cellule in fase di morte cellulare.
Introduction
La piroptosi è un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata che dipende principalmente dalla formazione dei pori della membrana plasmatica da parte di Gasdermin (GSDM) D nei mammiferi 1,2,3. A causa del deficit genetico di GSDMD nei polli 4,5, il meccanismo della piroptosi nei polli rimane sfuggente. La famiglia Gasdermin comprende proteine conservate, tra cui GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME e DFNB59 3,6. Gli studi hanno riportato che il GSDME dei pesci teleostei e delle anatre viene scisso dalla caspasi-1/3/7 o dalla caspasi-3/7 per indurre la morte cellulare piroptotica 7,8. Tuttavia, il ruolo della piroptosi mediata da GSDME nella risposta dell’ospite alle infezioni patogene nei polli rimane da chiarire.
La malattia infettiva delle borse (IBD) è una malattia acuta, altamente contagiosa e immunosoppressiva del pollame causata da IBDV9. IBDV, un virus a RNA a doppio filamento (ds) bisegmentato senza involucro, appartiene al genere Avibirnavirus della famiglia Birnaviridae10. Precedenti studi condotti da altri e dal nostro laboratorio hanno dimostrato che l’infezione da IBDV induce la morte cellulare nelle cellule ospiti attraverso diversi percorsi 11,12,13,14. Risultati precedenti hanno dimostrato che l’infezione da IBDV innesca il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH), un indicatore di morte delle cellule litiche 6,15, suggerendo che l’infezione da IBDV induce la morte delle cellule litiche nelle cellule ospiti. Inoltre, i dati mostrano che le cellule infettate da IBDV mostrano caratteristiche morfologiche di morte cellulare pirottotica, tra cui gonfiore cellulare con grandi bolle che soffiano dalla membrana plasmatica e colorazione positiva allo ioduro di propidio (PI), suggerendo che l’infezione da IBDV induce piroptosi nelle cellule.
Considerando che la formazione di pori di membrana nelle cellule pirottotiche da parte del frammento N-terminale di GSDM scisso (GSDM-NT) è un segno distintivo della piroptosi, teoricamente, le cellule pirottotiche potrebbero essere rilevate mediante citometria a flusso esaminando GSDM-NT sulla membrana cellulare utilizzando anticorpi specifici. Nelle cellule pirottotiche aviarie, il frammento N-terminale del Gasdermin E di pollo (chGSDME-NT) forma pori di membrana, consentendo allo ioduro di propidio (PI) di passare attraverso e legare il DNA. Pertanto, la proporzione di cellule pirottotiche può essere rilevata utilizzando la citometria a flusso, distinguendo così la piroptosi da altre forme di morte cellulare, come l’apoptosi e la necrosi. Tuttavia, il metodo per l’esame delle cellule pirottotiche mediante citometria a flusso non è stato riportato. In questo studio, le cellule DF-1 sono state infettate con IBDV ed è stata condotta una citometria a flusso per esaminare le cellule piroptotiche utilizzando anticorpi monoclonali (MCAB) contro il frammento chGSDME-NT (legato alla membrana) e la colorazione PI. Sorprendentemente, le cellule pirottotiche sono state efficacemente rilevate mediante citometria a flusso. Inoltre, è stato possibile quantificare la proporzione di celle pirottotiche. Questi risultati forniscono un mezzo potente ed efficace per determinare la piroptosi.
Questo articolo descrive un metodo per esaminare la piroptosi nelle cellule infette da IBDV mediante citometria a flusso utilizzando la colorazione anti-chGSDME-NT McAb e PI. Questo metodo può essere esteso anche ad altre cellule infettate da agenti patogeni e applicato per esaminare vari tipi di cellule con piroptosi, distinguendole da altre forme di morte cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive un metodo efficace per esaminare la piroptosi utilizzando la citometria a flusso, ottenuta attraverso la doppia colorazione delle cellule infette con Alexa Fluor 647 anti-chGSDME-NT MCAB e PI. Questo approccio può essere applicato anche a vari tipi di cellule per differenziare la piroptosi da altri tipi di morte cellulare, come l’apoptosi e la necrosi.
La piroptosi, un tipo infiammatorio di morte cellulare programmata che si basa principalmente sulla formaz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Jue Liu per la sua gentile assistenza. Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del National Key Research and Development Program of China (n. 2022YFD1800300), della National Natural Science Foundation of China (n. 32130105) e dell’Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (n. CARS-40), Cina.
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
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