Piroptozun Flow Sitometri ile İncelenmesi
Summary
Bu makale, tavuk GSDME (chGSDME-NT) ve propidyum iyodürün (PI) N-terminal fragmanına karşı antikorlarla ikili boyamadan sonra akış sitometrisi kullanılarak piroptotik hücrelerin tanımlanmasını açıklamaktadır.
Abstract
Piroptoz, ağırlıklı olarak parçalanmış Gasdermin (GSDM) ailesi proteinlerinden üretilen N-terminali tarafından plazma zarı gözeneklerinin oluşumu tarafından yönlendirilen inflamatuar bir programlanmış hücre ölümü türüdür. Membrana bağlı GSDM-NT’nin Western Blot ile incelenmesi piroptozu değerlendirmek için en sık kullanılan yöntemdir. Bununla birlikte, bu yöntemi kullanarak piroptozlu hücreleri diğer hücre ölümü formlarından ayırt etmek zordur. Bu çalışmada, Enfeksiyöz Bursal Hastalık Virüsü (IBDV) ile enfekte DF-1 hücreleri, tavuk GSDME’nin N-terminal fragmanına karşı spesifik antikorlar kullanılarak akış sitometrisi ile piroptoz geçiren hücrelerin oranını ölçmek için bir model olarak kullanıldı GSDME (chGSDME-NT) ve propidyum iyodür (PI) boyama. chGSDME-NT pozitif hücreler, Alexa Fluor 647 etiketli anti-chGSDME-NT antikorları kullanılarak akış sitometrisi ile kolayca tespit edilebilirdi. Ayrıca, IBDV ile enfekte olmuş hücrelerdeki chGSDME-NT / PI çift pozitif hücrelerin oranı (yaklaşık% 33), sahte enfekte kontrollerden önemli ölçüde daha yüksekti (P < 0.001). Bu bulgular, membrana bağlı chGSDME-NT’nin akım sitometri ile incelenmesinin, hücre ölümü geçiren hücreler arasında piroptotik hücrelerin belirlenmesinde etkili bir yaklaşım olduğunu göstermektedir.
Introduction
Piroptoz, esas olarak memelilerdeGasdermin (GSDM) D ile plazma zarı gözeneklerinin oluşumuna bağlı olan inflamatuar bir programlanmış hücre ölümü türüdür 1,2,3. Tavuklarda GSDMD’ningenetik eksikliği nedeniyle 4,5, tavuklarda piroptoz mekanizması belirsizliğini korumaktadır. Gasdermin ailesi, GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME ve DFNB59 3,6 dahil olmak üzere korunmuş proteinleri içerir. Çalışmalar, teleost balıklarından ve ördeklerden elde edilen GSDME’nin, piroptotik hücre ölümünü indüklemek için kaspaz-1/3/7 veya kaspaz-3/7 ile parçalandığını bildirmiştir 7,8. Bununla birlikte, tavuklarda patojenik enfeksiyonlara karşı konakçı yanıtında GSDME aracılı piroptozun rolü hala açıklığa kavuşturulmayı beklemektedir.
Enfeksiyöz bursal hastalık (İBH), İBH9’un neden olduğu akut, oldukça bulaşıcı ve immünsüpresif bir kanatlı hastalığıdır. Zarfsız iki segmentli çift sarmallı (ds) bir RNA virüsü olan IBDV, Birnaviridaeailesi 10’daki Avibirnavirus cinsine aittir. Başkaları ve laboratuvarımız tarafından yapılan önceki çalışmalar, İBH enfeksiyonunun konakçı hücrelerde farklı yolaklar yoluyla hücre ölümüne neden olduğunu göstermiştir 11,12,13,14. Önceki bulgular, İBH enfeksiyonunun litik hücre ölümünün bir göstergesi olanlaktat dehidrojenaz (LDH) salınımını tetiklediğini göstermiştir 6,15, bu da İBH enfeksiyonunun konakçı hücrelerde litik hücre ölümüne neden olduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, veriler, IBDV ile enfekte hücrelerin, plazma zarından üflenen büyük kabarcıklarla hücre şişmesi ve propidyum iyodür (PI) boyama pozitifi dahil olmak üzere piroptotik hücre ölümünün morfolojik özelliklerini sergilediğini göstermektedir, bu da IBDV enfeksiyonunun hücrelerde piroptozu indüklediğini düşündürmektedir.
Parçalanmış GSDM’nin (GSDM-NT) N-terminal fragmanı tarafından piroptotik hücrelerde membran gözeneklerinin oluşumunun piroptozisin ayırt edici bir özelliği olduğu göz önüne alındığında, teorik olarak, piroptotik hücreler, spesifik antikorlar kullanılarak hücre zarı üzerindeki GSDM-NT’yi inceleyerek akış sitometrisi ile tespit edilebilir. Kuş piroptotik hücrelerinde, tavuk Gasdermin E’nin (chGSDME-NT) N-terminal fragmanı, propidyum iyodürün (PI) DNA’dan geçmesine ve bağlanmasına izin veren zar gözenekleri oluşturur. Bu nedenle, piroptotik hücrelerin oranı akış sitometrisi kullanılarak tespit edilebilir, böylece piroptozu apoptoz ve nekroz gibi diğer hücre ölümü biçimlerinden ayırt eder. Bununla birlikte, piroptotik hücrelerin akış sitometrisi ile incelenmesi için yöntem bildirilmemiştir. Bu çalışmada, DF-1 hücreleri İBH ile enfekte edildi ve chGSDME-NT fragmanına (membrana bağlı) ve PI boyamasına karşı monoklonal antikorlar (MCAB) kullanılarak piroptotik hücrelerin incelenmesi için akış sitometrisi yapıldı. Şaşırtıcı bir şekilde, piroptotik hücreler akış sitometrisi ile etkili bir şekilde tespit edildi. Ayrıca, piroptotik hücrelerin oranı ölçülebilir. Bu bulgular piroptozu belirlemek için güçlü ve etkili bir yol sağlar.
Bu makale, IBDV ile enfekte hücrelerde piroptozu, anti-chGSDME-NT, McAb ve PI boyama kullanılarak akış sitometrisi ile incelemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem aynı zamanda diğer patojenle enfekte olmuş hücrelere de genişletilebilir ve piroptozlu çeşitli hücre tiplerini incelemek için uygulanabilir ve onları diğer hücre ölümü formlarından ayırt edebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, enfekte olmuş hücrelerin Alexa Fluor 647 etiketli anti-chGSDME-NT McAb ve PI ile ikili boyanması yoluyla elde edilen akış sitometrisi kullanılarak piroptozu incelemek için etkili bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaklaşım, piroptozu apoptoz ve nekroz gibi diğer hücre ölümü türlerinden ayırt etmek için çeşitli hücre tiplerine de uygulanabilir.
Memelilerde 1,2,3</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nazik yardımı için Dr. Jue Liu’ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (No. 2022YFD1800300), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 32130105) ve Modern Tarımsal Sanayi Teknolojisi Araştırma Sistemi için Tahsis Edilmiş Fon (No. CARS-40), Çin.
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
References
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9 (2022).
- De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
- Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526 (2022).
- Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
- Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
- Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
- Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724-e01819 (2020).
- Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
- Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
- Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).
.