Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Identifizierung pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie nach dualer Färbung mit Antikörpern gegen das N-terminale Fragment von Hühner-GSDME (chGSDME-NT) und Propidiumiodid (PI).
Abstract
Pyroptose ist eine entzündliche Form des programmierten Zelltods, die hauptsächlich durch die Bildung von Plasmamembranporen durch den N-Terminus angetrieben wird, die aus den gespaltenen Proteinen der Gasdermin-Familie (GSDM) erzeugt werden. Die Untersuchung von membrangebundenem GSDM-NT mittels Western Blot ist die am häufigsten verwendete Methode zur Beurteilung der Pyroptose. Allerdings ist es mit dieser Methode schwierig, Zellen mit Pyroptose von anderen Formen des Zelltods zu unterscheiden. In dieser Studie wurden mit dem Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) infizierte DF-1-Zellen als Modell verwendet, um den Anteil der Zellen, die einer Pyroptose unterzogen werden, mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren, wobei spezifische Antikörper gegen das N-terminale Fragment der Hühner-GSDME (chGSDME-NT) und Propidiumiodid (PI)-Färbung verwendet wurden. Die chGSDME-NT-positiven Zellen waren mittels Durchflusszytometrie mit Alexa Fluor 647-markierten Anti-chGSDME-NT-Antikörpern leicht nachweisbar. Darüber hinaus war der Anteil der doppelt positiven chGSDME-NT/PI-Zellen in IBDV-infizierten Zellen (rund 33 %) signifikant höher als in scheininfizierten Kontrollen (P < 0,001). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Untersuchung von membrangebundenem chGSDME-NT mittels Durchflusszytometrie ein wirksamer Ansatz zur Bestimmung pyroptotischer Zellen bei Zellen im Zelltod ist.
Introduction
Die Pyroptose ist eine entzündliche Form des programmierten Zelltods, die bei Säugetieren hauptsächlich von der Bildung von Plasmamembranporen durch Gasdermin (GSDM) D abhängt 1,2,3. Aufgrund des genetischen Mangels an GSDMD bei Hühnern 4,5 bleibt der Mechanismus der Pyroptose bei Hühnern schwer fassbar. Die Gasdermin-Familie umfasst konservierte Proteine, darunter GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDMME und DFNB59 3,6. Studien haben gezeigt, dass GSDME aus Teleostfischen und Enten durch Caspase-1/3/7 oder Caspase-3/7 gespalten wird, um den pyroptotischen Zelltod zu induzieren 7,8. Die Rolle der GSDME-vermittelten Pyroptose bei der Wirtsreaktion auf pathogene Infektionen bei Hühnern muss jedoch noch geklärt werden.
Die Infektiöse Schleimbeutelkrankheit (CED) ist eine akute, hochansteckende und immunsuppressive Geflügelkrankheit, die durch IBDV9 verursacht wird. IBDV, ein unbehülltes bi-segmentiertes doppelsträngiges (ds) RNA-Virus, gehört zur Gattung Avibirnavirus in der Familie der Birnaviridae10. Frühere Studien anderer und unseres Labors haben gezeigt, dass eine IBDV-Infektion den Zelltod in Wirtszellen über verschiedene Wege induziert 11,12,13,14. Frühere Ergebnisse haben gezeigt, dass eine IBDV-Infektion die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) auslöst, einem Indikator für den lytischen Zelltod 6,15, was darauf hindeutet, dass eine IBDV-Infektion den lytischen Zelltod in Wirtszellen induziert. Darüber hinaus zeigen die Daten, dass IBDV-infizierte Zellen morphologische Merkmale des pyroptotischen Zelltods aufweisen, einschließlich einer Zellschwellung mit großen Blasen, die aus der Plasmamembran wehen, und einer positiven Propidiumiodid (PI)-Färbung, was darauf hindeutet, dass eine IBDV-Infektion Pyroptose in Zellen induziert.
In Anbetracht der Tatsache, dass die Bildung von Membranporen in pyroptotischen Zellen durch das N-terminale Fragment von gespaltenem GSDM (GSDM-NT) ein Kennzeichen der Pyroptose ist, könnten pyroptotische Zellen theoretisch durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, indem GSDM-NT auf der Zellmembran mit spezifischen Antikörpern untersucht wird. In pyroptotischen Zellen von Vögeln bildet das N-terminale Fragment von Hühnergasdermin E (chGSDME-NT) Membranporen, die es Propidiumiodid (PI) ermöglichen, die DNA zu durchdringen und zu binden. So kann der Anteil pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen werden, wodurch die Pyroptose von anderen Formen des Zelltods, wie Apoptose und Nekrose, unterschieden wird. Über die Methode zur Untersuchung pyroptotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie wurde jedoch nicht berichtet. In dieser Studie wurden DF-1-Zellen mit IBDV infiziert, und es wurde eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um pyroptotische Zellen mit monoklonalen Antikörpern (McAb) gegen das chGSDME-NT-Fragment (membrangebunden) und PI-Färbung zu untersuchen. Überraschenderweise konnten pyroptotische Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie effektiv nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte der Anteil pyroptotischer Zellen quantifiziert werden. Diese Erkenntnisse stellen ein leistungsfähiges und effektives Mittel zur Bestimmung der Pyroptose dar.
In diesem Artikel wird eine Methode zur Untersuchung der Pyroptose in IBDV-infizierten Zellen mittels Durchflusszytometrie mittels anti-chGGME-NT, MCAB- und PI-Färbung beschrieben. Diese Methode kann auch auf andere erregerinfizierte Zellen ausgeweitet und angewendet werden, um verschiedene Zelltypen mit Pyroptose zu untersuchen und sie von anderen Formen des Zelltods zu unterscheiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine effektive Methode zur Untersuchung der Pyroptose mittels Durchflusszytometrie, die durch duale Färbung infizierter Zellen mit Alexa Fluor 647-markiertem anti-chGSDME-NT McAb und PI erreicht wird. Dieser Ansatz kann auch auf verschiedene Zelltypen angewendet werden, um die Pyroptose von anderen Arten des Zelltods, wie Apoptose und Nekrose, zu unterscheiden.
Pyroptose, eine entzündliche Art des programmierten Zelltods, die in erster Linie auf der D-ind…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Jue Liu für seine freundliche Unterstützung. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Key Research and Development Program of China (Nr. 2022YFD1800300), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 32130105) und des Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (Nr. CARS-40), China.
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
References
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