Examen de la piroptosis por citometría de flujo
Summary
En este artículo se describe la identificación de células piroptóticas mediante citometría de flujo tras tinción dual con anticuerpos contra el fragmento N-terminal de GSDME de pollo (chGSDME-NT) y yoduro de propidio (PI).
Abstract
La piroptosis es un tipo inflamatorio de muerte celular programada impulsada predominantemente por la formación de poros de la membrana plasmática por el N-terminal generado a partir de las proteínas de la familia Gasdermin escindida (GSDM). El examen de GSDM-NT unido a la membrana mediante Western Blot es el método más utilizado para evaluar la piroptosis. Sin embargo, es difícil diferenciar las células con piroptosis de otras formas de muerte celular utilizando este método. En este estudio, se emplearon células DF-1 infectadas por el virus de la bursitis infecciosa (IBDV) como modelo para cuantificar la proporción de células sometidas a piroptosis por citometría de flujo, utilizando anticuerpos específicos contra el fragmento N-terminal de GSDME de pollo (chGSDME-NT) y la tinción de yoduro de propidio (PI). Las células chGSDME-NT positivas fueron fácilmente detectables por citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-chGSDME-NT marcados con Alexa Fluor 647. Además, la proporción de células doble positivas chGSDME-NT/PI en las células infectadas por IBDV (alrededor del 33%) fue significativamente mayor que en los controles infectados simulados (P < 0,001). Estos hallazgos indican que el examen de chGSDME-NT unido a la membrana mediante citometría de flujo es un enfoque eficaz para determinar las células piroptóticas entre las células que experimentan muerte celular.
Introduction
La piroptosis es un tipo inflamatorio de muerte celular programada que depende principalmente de la formación de poros de la membrana plasmática por Gasdermin (GSDM) D en mamíferos 1,2,3. Debido a la deficiencia genética de GSDMD en pollos 4,5, el mecanismo de la piroptosis en pollos sigue siendo difícil de alcanzar. La familia Gasdermin comprende proteínas conservadas, incluyendo GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME y DFNB59 3,6. Los estudios han informado que la GSDME de peces y patos teleósteos es escindida por caspasa-1/3/7 o caspasa-3/7 para inducir la muerte celular piroptótica 7,8. Sin embargo, el papel de la piroptosis mediada por GSDME en la respuesta del huésped a las infecciones patógenas en los pollos aún no se ha dilucidado.
La enfermedad infecciosa de la bolsa (EII) es una enfermedad avícola aguda, altamente contagiosa e inmunosupresora causada por el IBDV9. El IBDV, un virus de ARN bicatenario (ds) bisegmentado sin envoltura, pertenece al género Avibirnavirus de la familia Birnaviridae10. Estudios previos realizados por otros y nuestro laboratorio han demostrado que la infección por IBDV induce la muerte celular en las células huésped a través de diferentes vías 11,12,13,14. Hallazgos previos han demostrado que la infección por IBDV desencadena la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), un indicador de muerte de células líticas 6,15, lo que sugiere que la infección por IBDV induce la muerte de células líticas en las células huésped. Además, los datos muestran que las células infectadas por IBDV exhiben características morfológicas de muerte celular piroptótica, incluida la hinchazón celular con grandes burbujas que salen de la membrana plasmática y la tinción positiva de yoduro de propidio (PI), lo que sugiere que la infección por IBDV induce piroptosis en las células.
Teniendo en cuenta que la formación de poros de membrana en las células piroptóticas por el fragmento N-terminal de GSDM escindido (GSDM-NT) es un sello distintivo de la piroptosis, teóricamente, las células piroptóticas podrían detectarse por citometría de flujo mediante el examen de GSDM-NT en la membrana celular utilizando anticuerpos específicos. En las células piroptóticas aviares, el fragmento N-terminal de la gasdermina E de pollo (chGSDME-NT) forma poros en la membrana, lo que permite que el yoduro de propidio (PI) pase a través del ADN y se una a él. De este modo, la proporción de células piroptóticas puede detectarse mediante citometría de flujo, distinguiendo así la piroptosis de otras formas de muerte celular, como la apoptosis y la necrosis. Sin embargo, no se ha descrito el método para examinar las células piroptóticas mediante citometría de flujo. En este estudio, las células DF-1 se infectaron con IBDV y se realizó una citometría de flujo para examinar las células piroptóticas utilizando anticuerpos monoclonales (McAb) contra el fragmento chGSDME-NT (unido a la membrana) y la tinción de PI. Sorprendentemente, las células piroptóticas se detectaron eficazmente mediante citometría de flujo. Además, se pudo cuantificar la proporción de células piroptóticas. Estos hallazgos proporcionan un medio poderoso y eficaz para determinar la piroptosis.
En este artículo se describe un método para examinar la piroptosis en células infectadas por IBDV mediante citometría de flujo utilizando tinción anti-chGSDME-NT, McAb y PI. Este método también puede extenderse a otras células infectadas por patógenos y aplicarse para examinar varios tipos de células con piroptosis, distinguiéndolas de otras formas de muerte celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe un método eficaz para examinar la piroptosis mediante citometría de flujo, logrado mediante la tinción dual de células infectadas con McAb y PI anti-chGSDME-NT marcados con Alexa Fluor 647. Este enfoque también se puede aplicar en varios tipos de células para diferenciar la piroptosis de otros tipos de muerte celular, como la apoptosis y la necrosis.
La piroptosis, un tipo inflamatorio de muerte celular programada que depende principalmente de la formac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Dr. Jue Liu por su amable asistencia. Este estudio contó con el apoyo de subvenciones del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (No. 2022YFD1800300), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 32130105) y el Fondo Asignado para el Sistema de Investigación de Tecnología Agroindustrial Moderna (No. CARS-40), China.
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
References
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9 (2022).
- De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
- Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526 (2022).
- Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
- Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
- Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
- Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724-e01819 (2020).
- Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
- Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
- Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).
