Исследование пироптоза методом проточной цитометрии
Summary
В данной статье описана идентификация пироптотических клеток с помощью проточной цитометрии после двойного окрашивания антителами против N-концевого фрагмента куриного GSDME (chGSDME-NT) и йодида пропидия (PI).
Abstract
Пироптоз — это воспалительный тип запрограммированной гибели клеток, вызванный преимущественно образованием пор плазматической мембраны N-концом, образованным из расщепленных белков семейства Gasdermin (GSDM). Исследование прикрепленного к мембране GSDM-NT методом вестерн-блоттинга является наиболее часто используемым методом оценки пироптоза. Однако дифференцировать клетки с пироптозом от других форм клеточной гибели с помощью этого метода сложно. В этом исследовании клетки DF-1, инфицированные вирусом инфекционной бурсальной болезни (IBDV), были использованы в качестве модели для количественной оценки доли клеток, подвергающихся пироптозу, с помощью проточной цитометрии с использованием специфических антител против N-концевого фрагмента куриного GSDME (chGSDME-NT) и окрашивания йодидом пропидия (PI). ChGSDME-NT-положительные клетки были легко обнаруживаемы с помощью проточной цитометрии с использованием меченых Alexa Fluor 647 антител против chGSDME-NT. Более того, доля двойных положительных клеток chGSDME-NT/PI в клетках, инфицированных IBDV (около 33%), была значительно выше, чем в контрольной группе с фиктивным инфицированием (P < 0,001). Эти результаты указывают на то, что исследование мембраносвязанного chGSDME-NT с помощью проточной цитометрии является эффективным подходом для определения пироптотических клеток среди клеток, подвергающихся клеточной гибели.
Introduction
Пироптоз является воспалительным типом запрограммированной гибели клеток, который в основном зависит от образования пор плазматической мембраны газдермином (GSDM) D у млекопитающих 1,2,3. Из-за генетической недостаточности GSDMD у цыплят 4,5 механизм пироптоза у цыплят остается неуловимым. Семейство Gasdermin включает консервативные белки, включая GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME и DFNB59 3,6. Исследования показали, что GSDME из костистых рыб и уток расщепляется каспазой-1/3/7 или каспазой-3/7, вызывая гибель пироптотических клеток 7,8. Тем не менее, роль GSDME-опосредованного пироптоза в ответе хозяина на патогенные инфекции у цыплят еще предстоит выяснить.
Инфекционная бурсальная болезнь (ВЗК) — это острое, высококонтагиозное и иммуносупрессивное заболевание домашней птицы, вызываемое ВЗК9. IBDV, безоболочечный двухцепочечный РНК-вирус, принадлежит к роду Avibirnavirus семейства Birnaviridae10. Предыдущие исследования, проведенные другими организациями и нашей лабораторией, показали, что инфекция ВЗК вызывает гибель клеток хозяина различными путями 11,12,13,14. Предыдущие результаты показали, что инфекция IBDV вызывает высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH), показателя гибели литических клеток 6,15, что позволяет предположить, что инфекция IBDV вызывает гибель литических клеток в клетках-хозяевах. Кроме того, данные показывают, что клетки, инфицированные IBDV, демонстрируют морфологические особенности пироптотической гибели клеток, включая набухание клеток с крупными пузырьками, выдувающимися из плазматической мембраны, и положительное окрашивание пропидида йодидом (PI), что позволяет предположить, что инфекция IBDV вызывает пироптоз в клетках.
Учитывая, что образование мембранных пор в пироптотических клетках N-концевым фрагментом расщепленного GSDM (GSDM-NT) является отличительной чертой пироптоза, теоретически пироптотические клетки могут быть обнаружены методом проточной цитометрии путем исследования GSDM-NT на клеточной мембране с использованием специфических антител. В пироптотических клетках птиц N-концевой фрагмент куриного гасдермина Е (chGSDME-NT) образует мембранные поры, позволяя йодиду пропидия (PI) проходить через ДНК и связываться с ней. Таким образом, долю пироптотических клеток можно определить с помощью проточной цитометрии, тем самым отличая пироптоз от других форм гибели клеток, таких как апоптоз и некроз. Однако о методе исследования пироптотических клеток методом проточной цитометрии не сообщалось. В этом исследовании клетки DF-1 были инфицированы IBDV, и была проведена проточная цитометрия для изучения пироптотических клеток с использованием моноклональных антител (MCAB) против фрагмента chGSDME-NT (мембранно-связанного) и окрашивания PI. Удивительно, но пироптотические клетки были эффективно обнаружены с помощью проточной цитометрии. Кроме того, можно количественно определить долю пироптотических клеток. Эти результаты являются мощным и эффективным средством для определения пироптоза.
В данной статье описан метод исследования пироптоза в клетках, инфицированных IBDV, методом проточной цитометрии с использованием окрашивания анти-chGSDME-NT McAb и PI. Этот метод также может быть распространен на другие клетки, инфицированные патогенами, и применен для исследования различных типов клеток с пироптозом, отличая их от других форм клеточной смерти.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной статье описан эффективный метод исследования пироптоза с помощью проточной цитометрии, полученный путем двойного окрашивания инфицированных клеток мечеными Alexa Fluor 647 анти-chGSDME-NT McAb и PI. Этот подход также может быть применен к различным типам клеток для дифференциации пи?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить доктора Цзюэ Лю за его любезную помощь. Данное исследование было поддержано грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (No 2022YFD1800300), Национального фонда естественных наук Китая (No 32130105) и Целевого фонда современной системы исследований в области агропромышленных технологий (No 2022YFD1800300), Национального фонда естественных наук Китая (No ) и Целевого фонда современной системы исследований в области агропромышленных технологий (No 2022YFD1800300). CARS-40), Китай.
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
References
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9 (2022).
- De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
- Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526 (2022).
- Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
- Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
- Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
- Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724-e01819 (2020).
- Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
- Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
- Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).
.