בדיקת פירופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה
Summary
מאמר זה מתאר זיהוי של תאים פירופטוטיים באמצעות ציטומטריית זרימה לאחר צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד שבר N-terminal של עוף GSDME (chGSDME-NT) ופרופידיום יודיד (PI).
Abstract
פירופטוזיס הוא סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת המונע בעיקר על ידי היווצרות נקבוביות קרום הפלזמה על ידי N-terminus שנוצר מחלבונים ממשפחת Gasdermin (GSDM). בדיקת GSDM-NT המחוברת לקרום על ידי Western Blot היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת פירופטוזיס. עם זאת, קשה להבדיל תאים עם פירופטוזיס מצורות אחרות של מוות תאי באמצעות שיטה זו. במחקר זה, תאי DF-1 נגועים בנגיף מחלת בורסל זיהומית (IBDV) שימשו כמודל לכימות שיעור התאים שעברו פירופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים כנגד מקטע N-terminal של GSDME עוף (chGSDME-NT) וצביעת פרופידיום יודיד (PI). התאים החיוביים chGSDME-NT היו ניתנים לזיהוי בקלות על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות נוגדנים אנטי-chGSDME-NT של Alexa Fluor 647. יתר על כן, חלקם של תאים חיוביים כפולים chGSDME-NT/PI בתאים נגועים ב- IBDV (כ -33%) היה גדול משמעותית מאשר בביקורת נגועה מדומה (P < 0.001). ממצאים אלה מצביעים על כך שבחינה של chGSDME-NT הקשור לקרום על ידי ציטומטריית זרימה היא גישה יעילה לקביעת תאים פירופטוטיים בקרב תאים העוברים מוות תאי.
Introduction
פירופטוזיס הוא סוג דלקתי של מוות תאי מתוכנת התלוי בעיקר בהיווצרות נקבוביות קרום הפלזמה על ידי Gasdermin (GSDM) D ביונקים 1,2,3. בשל מחסור גנטי של GSDMD בתרנגולות 4,5, מנגנון הפירופטוזיס בתרנגולות נותר חמקמק. משפחת Gasdermin כוללת חלבונים משומרים, כולל GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME ו-DFNB59 3,6. מחקרים דיווחו כי GSDME מדגי טלאוסט וברווזים נבקע על ידי קספאז-1/3/7 או קספאז-3/7 כדי לגרום למוות של תאים פירופטוטיים 7,8. עם זאת, התפקיד של פירופטוזיס בתיווך GSDME בתגובת המארח לזיהומים פתוגניים בתרנגולות עדיין לא ברור.
מחלת בורסל זיהומית (IBD) היא מחלת עופות חריפה, מדבקת מאוד ומדכאת חיסון הנגרמת על ידי IBDV9. IBDV, נגיף RNA דו-גדילי דו-סגמנטי (ds) שאינו עטוף, שייך לסוג Avibirnavirus במשפחת Birnaviridae10. מחקרים קודמים שנערכו על ידי אחרים והמעבדה שלנו הראו כי זיהום IBDV גורם למוות תאי בתאים מארחים דרך מסלולים שונים 11,12,13,14. ממצאים קודמים הראו כי זיהום IBDV מעורר שחרור של לקטט דהידרוגנאז (LDH), אינדיקטור למוות של תאים ליטיים 6,15, דבר המצביע על כך שזיהום IBDV גורם למוות של תאים ליטיים בתאים מארחים. יתר על כן, הנתונים מראים כי תאים נגועים ב- IBDV מפגינים מאפיינים מורפולוגיים של מוות תאי פירופטוטי, כולל נפיחות תאים עם בועות גדולות הנושבות מממברנת הפלזמה ופרופידיום יודיד (PI) – מכתים חיובי, דבר המצביע על כך שזיהום IBDV גורם לפירופטוזיס בתאים.
בהתחשב בכך שהיווצרות נקבוביות הממברנה בתאים פירופטוטיים על ידי מקטע N-terminal של GSDM שסוע (GSDM-NT) היא סימן היכר של פירופטוזיס, תיאורטית, תאים פירופטוטיים יכולים להיות מזוהים על ידי ציטומטריית זרימה על ידי בחינת GSDM-NT על קרום התא באמצעות נוגדנים ספציפיים. בתאים פירופטוטיים של עופות, המקטע N-terminal של עוף Gasdermin E (chGSDME-NT) יוצר נקבוביות ממברנה, ומאפשר לפרופידיום יודיד (PI) לעבור דרך DNA ולקשור אותו. לפיכך, ניתן לזהות את חלקם של תאים פירופטוטיים באמצעות ציטומטריית זרימה, ובכך להבדיל פירופטוזיס מצורות אחרות של מוות תאי, כגון אפופטוזיס ונמק. עם זאת, השיטה לבדיקת תאים פירופטוטיים על ידי ציטומטריית זרימה לא דווחה. במחקר זה, תאי DF-1 היו נגועים ב- IBDV, וציטומטריית זרימה נערכה כדי לבחון תאים פירופטוטיים באמצעות נוגדנים חד שבטיים (McAb) כנגד מקטע chGSDME-NT (קשור לקרום) וצביעת PI. באופן מפתיע, תאים פירופטוטיים זוהו ביעילות על ידי ציטומטריית זרימה. יתר על כן, ניתן לכמת את חלקם של תאים פירופטוטיים. ממצאים אלה מספקים אמצעי רב עוצמה ויעיל לקביעת פירופטוזיס.
מאמר זה מתאר שיטה לבדיקת פירופטוזיס בתאים נגועים ב- IBDV על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות צביעת אנטי-chGSDME-NT, McAb ו- PI. שיטה זו יכולה להיות מורחבת גם לתאים נגועים אחרים בפתוגן וליישם כדי לבחון סוגי תאים שונים עם פירופטוזיס, להבדיל אותם מצורות אחרות של מוות תאי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה יעילה לבדיקת פירופטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה, המושגת באמצעות צביעה כפולה של תאים נגועים עם Alexa Fluor 647-labeled anti-chGSDME-NT McAb ו-PI. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על סוגי תאים שונים כדי להבדיל פירופטוזיס מסוגים אחרים של מוות תאי, כגון אפופטוזיס ונמק.
פירופטו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר ג’ו ליו על עזרתו האדיבה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מס ‘2022YFD1800300), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘32130105), והקרן המיועדת למערכת מחקר טכנולוגית מודרנית של אגרו-תעשייה (מס ‘. CARS-40), סין.
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
References
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9 (2022).
- De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
- Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526 (2022).
- Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
- Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
- Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
- Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724-e01819 (2020).
- Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
- Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
- Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).
