היווצרות אורגנואידים של בלוטת התימוס האנושית בהידרוג'לים תלת מימדיים של פיברין

קו hiPSC hiN.Fm.m.Lon71.019 נוצר מפיברובלסטים בוגרים זכרים ותוכנת מחדש באמצעות טרנספקציית mRNA. קו hiPSC hiN.Fm.f.Lon80.002 נוצר מנקבות פיברובלסטים בוגרות ותוכנת מחדש באמצעות טרנספקציית mRNA. קו hiPSC hiN.Fs.f.MIPS203.003 נוצר מפיברובלסטים בוגרים של נקבות ותוכנת מחדש באמצעות זיהום וקטורי נגיפי רקומביננטי של סנדאי. כל קווי התאים סופקו על ידי פלטפורמת נאנט iPSC. חולים נתנו הסכמה מדעת לשימוש בתאים שלהם למטרות מחקר (אוסף אנונימי, Lonza, cat # CC-2511). ETPs ראשוניים מבודדים על ידי דיסוציאציה של דגימות תימיות אנושיות לאחר הלידה המתקבלות כפסולת מושלכת אנונימית מחולים שעברו ניתוח לב ילדים בבית החולים נאנט’ (CHU נאנט) באותו יום, בהתאם לתקנות CODECOH הצרפתיות תחת הצהרה DC-2017-2987. 1. הבחנה מכוונת של iPSCs כלפי זהות TEP הערה: מאז העבודות הראשונות שפורסמו על ידי לאי וג’ין המדגימות את ההתמיינות של תאי גזע עובריים מורינים (EScs) לקראת זהות אפיתל תימית28, מספר מחקרים פיתחו וייעלו פרוטוקולים המתארים את ההתמיינות המכוונת של תאי iPS אנושיים לזהות TEP 21,24,25,26,27,29 . מחקרים אלה מובילים להבחנה בין TEPs המבטאים סמני זהות אפיתליאליים תימיים כגון FOXN1 ו- PAX9 24,25,28,30, כמו גם סמני פונקציונליות כגון DLL4 ו- AIRE26, אך חסרים סמני התבגרות TEC24,25. שתי גישות הוכחו כתומכות בהבשלה של TEPs מובחנים לזהות TEC בוגרת: השתלה במודל in vivo כגון עכברים29, וצבירה מחדש למערכות אורגנואידים תימיות תלת-ממדיות המעובדות במערך ממשק אוויר-נוזל21. שתי המערכות הדגימו את התפקיד המכריע שממלא המבנה התלת-ממדי בשמירה ותמיכה בהבשלה של אוכלוסיות TEC פונקציונליות המסוגלות לתמוך בלימפופואזיס T in vivo או in vitro T 15,24,25,31. עבור מערכת האורגנואידים התימיים ששימשה במחקר זה, בצע את ההתמיינות של תאי iPS לקראת זהות TEP בעקבות פרוטוקול שפותח ומפורט ב- Provin et al.23. 2. בידוד של ETPs ראשוניים מדגימה תימית בילדים הערה: ETPs הם אבות שמקורם במח עצם היוצרים את שושלת תאי T ולתאים דנדריטיים בתוך בלוטת התימוס ומציגים את הפנוטיפ הבא: CD3- CD4- CD8- CD14- CD19- CD56- CD45+ CD34+ CD7+32,33. הכנת חרוזי הדלדוליום לפני, להעביר חרוזי בידוד תאים מגנטיים (טבלה של חומרים) לצינור 15 מ”ל ולשטוף עם 4 מ”ל של מאגר בידוד (PBS + 0.1% BSA + 2 mM EDTA). הניחו את הצינור במעמד המגנטי, הסירו את הסופרנטנט והוסיפו 2 מ”ל של חיץ בידוד. הוסף נוגדנים נגד עכבר CD3, CD4 ו- CD8 לחרוזים ודגור במשך 45 דקות ב 4 ° C תחת תסיסה. הניחו את הצינור במעמד המגנטי, שטפו אותו מספר פעמים במאגר בידוד והשעו אותו מחדש ב-20 מ”ל של מאגר בידוד. דיסוציאציה של דגימת בלוטת התימוסמעבירים דגימות תימוס טריות לצלחת פטרי מלאה RPMI1640 (טבלת חומרים). חותכים אותו עם מספריים סטריליים דיסקציה צבת לחתיכות על 1 מ”מ3 גודל. עם פיפטה 25 מ”ל, לשטוף את המדיום ואת שברים מספר פעמים (המדיום צריך להפוך מעונן), ולאחר מכן לאפשר את השברים לשקוע ולאסוף מחצית המדיום לתוך צינור 50 מ”ל. מוסיפים עוד מדיום וחוזרים על הפעולה עד שהמדיום נשאר נקי. אספו את המדיום לכמה שיותר צינורות של 50 מ”ל לפי הצורך, וסובבו את הצינורות ב 200 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את הכדורים ב 10 מ”ל של תמיסת ליזה של תאי דם אדומים (טבלה של חומרים). יש לדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות ולהוסיף 20 מ”ל של מאגר כביסה (PBS + 0.5% BSA + 4 mM EDTA + 1% פניצילין/סטרפטומיצין). סובבים ב 200 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. יש להשהות מחדש את הכדוריות ב-10 מ”ל של חיץ כביסה, לסנן דרך מסנן רשת של 70 מיקרומטר ולספור את התאים. העשרת ETPלאחר ספירת התאים, התאימו את עוצמת הקול ל -10 מ”ל לכל צינור באמצעות מאגר הכביסה. הוסף את הכמות הנדרשת של חרוזי בידוד תאים (לכל 200 מיליון תאים, השתמש 500 μL של חרוזים ב 20 מ”ל של חיץ בידוד) ודגור ב 4 ° C תחת תסיסה במשך 30 דקות. הניחו את הצינור על המעמד המגנטי למשך 2 דקות, ואספו בזהירות את הסופרנאטנט בצינור נקי. הסר את הצינור ונקה את החרוזים עם 20 מ”ל של חיץ בידוד. סובבו את הצינור, הניחו אותו בחזרה על המעמד המגנטי ואספו את הסופרנטנט. חזור על שלב זה פעמיים. סובבו את הסופרנאטנטים במהירות של 200 x גרם במשך 5 דקות. להשהות מחדש את הכדוריות ב 2 מ”ל של מאגר בידוד ולספור את התאים. בידוד ETPהתאימו את הריכוז ל-200 מיליון תאים למ”ל ואספו נפח קטן כבקרה לא מוכתמת. תייג את התאים עם שושלת אנטי-אנושית של עכבר (Lin) (CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD56), CD7 ונוגדנים CD34 (השתמש באותו פלואורוכרום עבור כל סמני לין). יש לדגור ב-4°C למשך 45 דקות. שטפו את התאים בנפח שווה של מאגר כביסה. סובב את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות, להשעות את הגלולה ב 1 מ”ל, ולספור את התאים. התאימו את הנפח לריכוז של 50 מיליון תאים למ”ל וסננו את התאים דרך מסנן רשת של 70 מיקרומטר. הוסף את סמן הכדאיות לבחירה ומיין תאי Lin- CD34+ CD7+ חיים לפי ציטומטריית זרימה באמצעות זרבובית 70 מיקרומטר. 3. 3D תרבית אורגנואידים תימית הכנת TEPמיד לאחר בידוד ETP, שלוט באיכות תרבית TEP בימים 13-15. ודאו שהתאים מגיעים למפגש ויוצרים שכבה חד-שכבתית צפופה עם בליטות (איור 1). כדי לקצור את TEPs ממוין, לשטוף את התאים עם DPBS-/-, להסיר אותו, להוסיף 1 מ”ל של TrypLE (טבלה של חומרים) לכל באר, לדגור ב 37 ° C במשך 5-7 דקות. הוסף 1 מ”ל של XVIVO10 (טבלה של חומרים) לכל באר, לשטוף מספר פעמים כדי לנתק את התאים, להעביר צינור 15 מ”ל, ולסובב ב 200 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ”ל של XVIVO10, ולספור את התאים.הערה: כדי להעריך את יעילות ההתמיינות מבעוד מועד, השתמש היטב בתרבית בנפרד ואמת את הביטוי של FOXN1 ו-PAX9 על-ידי RT-qPCR ואת תפוקת ההתמיינות על-ידי ציטומטריית זרימה (מחושב כשבר של תאי EPCAM+ CD205+, שאמור להיות מעל 50%) (איור 1). בשלב זה של התמיינות, כמעט כל תאי EPCAM+ חיוביים גם עבור CD205, המעידים על זהותם המבשרת11. הכנת ETPמיד לאחר בידוד ETP, סובב את צינור האיסוף ב 200 x גרם במשך 5 דקות. להשעות את הגלולה ב 1 מ”ל של XVIVO10 ולספור את התאים. צבירת אורגנואידים תימייםפיפטה את הנפחים המתאימים ומאגדת את שני מתלי התאים בריכוז של 2,00,000 TEP ו 40,000 ETP למ”ל, פיפטה עדינה למעלה ולמטה פעם אחת כדי הומוגניזציה. הוסף את התוספים המתאימים לפי טבלה 1, וצלחת 100 μL של תרחיף התא המעורב לכל באר בלוחות U תחתונים בעלי קשירה נמוכה 96 בארות. השתמש פיפטה רב ערוצית עבור פלט מוגבר; עם זאת, פיפטה קלאסית בעלת קצה אחד מגבילה אובדן נפחים של תאים יקרים. לדגור על הצלחות ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך הלילה. הכנת ההידרוג’ליםהערה: מערך הניסוי המשמש ליצירת הידרוג’ל, זריעת אורגנואידים ופיזור מדיום תרבית מוצג באיור 2.למחרת (יום 1 של שלב תרבית האורגנואידים), להפשיר aliquots של תרומבין (10 U / mL), Aprotinin (26,000 U / mL), ו פיברינוגן (8 מ”ג / מ”ל) (טבלה של חומרים). להפשיר את טרומבין ו aprotinin על קרח ואת פיברינוגן באמבט מים 37 מעלות צלזיוס (לא לשים אותו על קרח, כפי שהוא יהיה לזרז). אין לערבל, אלא להניח את aliquots מתחת למכסה המנוע הומוגנית אותם על ידי pipetting עדין. הכינו כמה תוספות תלויות לפי הצורך למספר האורגנואידים המיוצרים בהתאם ליחסים המוצגים בטבלה 2. מניחים את התוספות לבארות התרבית באמצעות צבת סטרילית, ומשאירים לפחות טור אחד או שורה אחת ריקה בצלחת התרבית. הכינו כמה שיותר צינורות של 1.5 מ”ל כמו ג’לים ליצוק. בכל צינור, פיפטה תחילה את הנפחים הנדרשים של פיברינוגן ואפרוטנין כמפורט בטבלה 2. בפעם השנייה, להוסיף את נפח תרומבין הנדרש לתוך צינור אחד, במהירות לשטוף 2 פעמים מבלי ליצור בועות כדי הומוגניזציה של ריאגנטים, ולאחר מכן לצייר את כל התוכן של הצינור במהירות לשטוף את התערובת לתוך הכנס התלוי. מקמו את הפיפטה במאונך מעל מרכז האינסרט ושטפו בעדינות את תערובת הריאגנט מבלי ליצור בועות.הערה: בשלב זה, מהירות הביצוע היא קריטית מכיוון שריאגנטים יעברו פילמור תוך מספר שניות, וחשוב לערבב אותם בצורה נכונה כדי למנוע היווצרות גושים או צפיפות לא אחידה בג’ל. המשך באר אחת בכל פעם באמצעות צינור שונה של 1.5 מ”ל עבור כל באר (אם נעשה שימוש חוזר בצינור למספר בארות, גושי ג’ל מוצקים שנותרו עלולים לחסום את קצה הפיפטה). אם הפילמור מתרחש מהר מדי בגלל הפעילות הגבוהה של הטרומבין, השתמש בדילול 1:2. מיד לאחר היציקה, הג’לים חייבים להיות שקופים עד מעט שקופים ועדיין לזרום לאחר מספר שניות כאשר הצלחת מוטה אנכית. דגרו במשך שעה אחת לפחות בטמפרטורה של 37°C עד שהתמיסה השקופה מתמצקת והופכת ללבנה אטומה, והג’לים נשארים יציבים במקומם כאשר הצלחת מוטה אנכית (איור 2A). זריעה אורגנואידיתודא את האיכות של שלב הצבירה. ודאו שהמיקרו-מסות יוצרות מסות תאים כדוריות, עם ליבה קומפקטית שמוקפת בהילה בצפיפות נמוכה יותר של ETPs (איור 3). חתכו את קצה חרוט P200 ושטפו אותו בתמיסה נוגדת היצמדות (Table of Materials). כדי לקצור את מסת התא, הטו את הצלחת למצב כמעט אנכי: המיקרו-מסות ישקעו אל הקיר התחתון של הבארות וניתן יהיה לשחזר אותן בקלות על ידי דחיפה הדרגתית של קצה הפיפטה לתחתית הבאר תוך כדי שאיפה. זרעו את המסה בחלק העליון של ההידרוג’לים על-ידי הפקדתם בעדינות מבלי לגעת בג’ל עם קצה הפיפטה, בהתאם ליחסים המוצגים בטבלה 1 (איור 2B). גם אם האורגנואידים נראים צפים חופשי בשלב זה, כאשר הם נפוחים ממדיום התרבית, הג’ל יתרכך, והאורגנואידים יתמקמו בשכבה העליונה. בדקו תחת המיקרוסקופ שלא נותר אורגנואיד בבארות P96. הכינו את הנפח הנדרש של מדיום התרבית לפי טבלה 1 וטבלה 2, ובכל באר הוסיפו לאט רבע מהנפח בחלק העליון של ההידרוג’לים מבלי לגעת בהם על ידי פיפטינג לאורך דפנות ההחדרה ואת שלושת רבעי הנותרים בתחתית הבאר על ידי מיקום הפיפטה בין זרועות האינסרט התלוי (איור 2C). מניחים 1 מ”ל של PBS בבארות התרבית הריקות כדי לשמור על לחות בצלחת. יש לדגור ב-37°C וב-5% CO2. תרבית אורגנואידים תימיתביום השני, בדקו אם האורגנואידים נזרעו היטב: ההידרוג’לים כנראה נשארו במקומם, והאורגנואידים כנראה לא שקעו בתחתית העלון. הכינו את כמות אמצעי התרבות הנדרשת לפי טבלה 1 וטבלה 2. הסר את המדיום על ידי הכוונת קצה חרוט השאיפה בין זרועות הכנס התלוי, תוך הקפדה לא לגעת בג’ל. מוסיפים את המדיום החדש על ידי מיקום פיפטה באותו אופן. שנה את התווך כל יומיים, ועבור למדיום השלב השני (טבלה 1) לאחר 2 עד 4 ימים (ביום ה-18 שלאחר תחילת התמיינות TEP).הערה: ניתן לשמור את אצווה אורגנואיד בתרבית באופן זה עד 6 שבועות. קציר אורגנואידיםהכינו צינור של 15 מ”ל עם 1 מ”ל של טריפל לכל באר לקציר. חתכו את קצה חרוט P1000 וציפו אותו בתמיסה נגד היצמדות. מחזירים בעדינות את הג’ל על ידי הנחת קצה הפיפטה אנכית במרכז התוספות (נזהרים לא לנקב את הממברנה) ומעבירים לצינור הטריפל. שוטפים את קרום האינסרט עם TrypLE ומעבירים גם לצינור. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות, ולערבל בעדינות במרווחים של 5 דקות. ודא שהג’לים והאורגנואידים מתנתקים. לאחר 15 דקות, מסננים מסנן רשת בגודל 70 מיקרומטר ומסתובבים במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות. השהה מחדש את הגלולה במאגר הכביסה והמשך לשיטה האנליטית של בחירה.