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Developmental Biology

Formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali

Published: October 04, 2024
doi:
10.3791/66795
, , , , , ,
1Nantes Université, CHU Nantes, INSERM, Center for Research in Transplantation and Translational Immunology, UMR 1064, 2CHU Nantes, Nantes Université, Department of Pediatric and Congenital Cardiac Surgery, 3Nantes Université, CHU Nantes, INSERM, CNRS, BioCore, SFR Bonamy

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per la formazione di organoidi di timo derivati da iPSC umane cresciuti in idrogel di fibrina 3D con l’obiettivo di supportare la maturazione delle cellule epiteliali timiche (TEC) e il mantenimento prolungato, nonché la timopoiesi in vitro.

Abstract

La generazione di un repertorio di cellule T funzionali e autotolleranti è un processo complesso che dipende dal microambiente timico e, principalmente, dalle proprietà della sua matrice extracellulare (ECM). Le cellule epiteliali del timo (TEC) sono fondamentali nella timopoiesi, nutrendo e selezionando le cellule T in via di sviluppo filtrando i cloni autoreattivi. È stato empiricamente dimostrato che le TEC sono particolarmente sensibili agli indizi fisici e chimici forniti dalla ECM e la classica coltura cellulare monostrato porta a una rapida perdita di funzionalità fino alla loro morte. A causa di questa delicata manutenzione combinata con la relativa rarità, e nonostante l’elevata posta in gioco nella modellazione della biologia del timo in vitro, mancano ancora modelli in grado di imitare fedelmente la nicchia TEC su larga scala e nel tempo. Qui, descriviamo la formazione di un modello multicellulare di organoide del timo umano, in cui il compartimento TEC è derivato da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e riaggregato con progenitori primari dei primi timociti in un idrogel tridimensionale (3D) a base di fibrina. Questo modello risponde alle attuali esigenze di un sistema di coltura scalabile che riproduca il microambiente timico ex vivo e dimostri la funzionalità, cioè la capacità di produrre cellule T e di supportare la crescita degli organoidi del timo per diverse settimane. Pertanto, proponiamo un modello pratico in vitro della funzionalità del timo attraverso organoidi derivati da iPSC che gioverebbe alla ricerca sulla biologia delle TEC e sulla generazione di cellule T ex vivo.

Introduction

Il timo è un organo linfoide primario che svolge un ruolo essenziale nella generazione di un sistema immunitario competente e tollerante 1,2,3. I progenitori primitivi del timo (ETP) migrano dal midollo osseo al timo, dove si espandono e si differenziano in cellule T funzionali 1,2,4,5. Questi processi sono mediati da una popolazione specializzata, le cellule epiteliali timoiche (TEC)2,6,7. I TEC derivano dai progenitori epiteliali del timo (TEPs)8,9 e comprendono TEC corticali (cTEC) e TEC midollari (mTEC) che svolgono ruoli specifici nella creazione del microambiente 3D specializzato necessario per la migrazione, l’espansione e la maturazione delle cellule T. I TEC mediano lo sviluppo delle cellule T principalmente fornendo fattori di crescita e differenziazione 1,10,11 e selezionando negativamente timociti non funzionali e non tolleranti attraverso la presentazione di autoantigeni 5,7,12. Le complesse interazioni tra le cellule T in via di sviluppo e le TEC svolgono anche un ruolo centrale nella maturazione e nell’organizzazione 3D delle popolazioni di TEC in un processo noto come crosstalk timico 1,11. Le interazioni tra le popolazioni cellulari del timo dipendono profondamente dal microambiente specifico modellato dalla matrice extracellulare (ECM). La ECM timica si trova in uno stato di reciprocità dinamica con le popolazioni di cellule timiche, influenzando la regolazione genica e venendo costantemente rimodellata in cambio dalla secrezione di enzimi o proteine della matrice13. La MEC influenza le cellule attraverso la modifica della biodisponibilità dei fattori di crescita e delle citochine, la segnalazione diretta attraverso i recettori legati alla membrana come le integrine e modellando i citoscheletri attraverso le forze fisiche14. È stato dimostrato che i componenti della ECM timica, come il collagene e la laminina, hanno un’elevata affinità per i fattori di crescita TGFb e FGF, che sono cruciali per il mantenimento dei TEC e per fissarli formando complessi. Anche la plasticità della ECM timica, il modulo elastico e la densità svolgono un ruolo cruciale nell’istruire il destino della TEC e nel modellare la compartimentazione del timo, che è essenziale per la sua funzionalità. Questi indizi evidenziano l’importanza di prendere in considerazione la MEC e la sua struttura 3D per imitare il timo ex vivo. Questo punto è supportato dal fatto che i TEC primari si dedifferenziano rapidamente, perdono la loro funzionalità e alla fine muoiono quando vengono coltivati in configurazioni di coltura cellulare classiche 15,16,17.

Sono stati sviluppati modelli di coltura per espandere le popolazioni funzionali di TEC da espianti di timo umano al fine di conservare la struttura della MEC e gli indizi cruciali che fornisce ai TEC 18,19,20. Questo sistema di coltura è stato in grado di espandere e mantenere con successo una popolazione di TEC funzionali in vitro, ma non è stato possibile sostenere oltre 7-8 giorni di coltura18. Pertanto, lo sviluppo di un sistema di coltura 3D accessibile e pratico in grado di riprodurre il microambiente timico e la sua funzionalità in vitro e a lungo termine è una posta in gioco cruciale nel campo. Recentemente, lo sviluppo di sistemi di coltura 3D basati su idrogel ha portato alla nascita di diversi sistemi di organoidi timici artificiali, costituendo un importante progresso per la modellizzazione timica in vitro 15,16,21,22. Abbiamo sviluppato un sistema di co-coltura di organoidi timici umani (hTO) attraverso la riaggregazione di ETP primari umani con TEP umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) in sferoidi e la loro semina su un idrogel di fibrina.

La scelta del materiale e della configurazione dell’idrogel in questo studio mirava a riprodurre la struttura nativa della ECM timica mantenendo la praticità e la capacità di scalare il processo per ottenere una fonte di materiale economica e abbondante per gli esperimenti15. Questo sistema hTO mostra un potenziale di differenziazione multilineage e può supportare una timopoiesi produttiva dagli ETP23. Questo sistema organoidrico costituisce uno strumento affidabile per lo studio delle interazioni cellulari intratimmiche e la modellazione della linfopoiesi umana normale e patologica. L’uso di cellule iPS introduce anche capacità di editing genetico nel modello. La differenziazione efficace delle iPSC in tessuto timico funzionale è stato un obiettivo di lunga data del campo negli ultimi 15 anni e sono stati compiuti progressi significativi con la decifrazione della segnalazione del destino del lignaggio TEC 21,24,25,26,27. Per rispondere alla necessità di un tale modello 3D di timo in vitro, questa nota tecnica descrive i metodi e i dettagli tecnici per la generazione graduale di organoidi di timo umano derivati da iPSC, concentrandosi sulla formazione di scaffold di idrogel, sulla riaggregazione e la semina di micromasse cellulari e sulla coltura e la raccolta di organoidi.

Protocol

La linea hiPSC hiN.Fm.m.Lon71.019 è stata generata da fibroblasti maschi adulti e riprogrammata tramite trasfezione di mRNA. La linea hiPSC hiN.Fm.f.Lon80.002 è stata generata da fibroblasti adulti femmine e riprogrammata tramite trasfezione di mRNA. La linea hiPSC hiN.Fs.f.MIPS203.003 è stata generata da fibroblasti adulti di sesso femminile e riprogrammata tramite infezione da vettore virale Sendai ricombinante. Tutte le linee cellulari sono state fornite dalla piattaforma Nantes iPSC. I pazienti hanno dato il consenso informato all’utilizzo delle loro cellule per scopi di ricerca (raccolta anonima, Lonza, cat # CC-2511). Gli ETP primari sono isolati mediante dissociazione di campioni di timo umano postnatale ottenuti come rifiuti anonimizzati scartati da pazienti sottoposti a cardiochirurgia pediatrica presso l’Ospedale di Nantes (CHU Nantes) lo stesso giorno, in conformità con il regolamento francese CODECOH alla dichiarazione DC-2017-2987. 1. Differenziazione diretta delle iPSC verso un’identità TEP NOTA: A partire dai primi lavori pubblicati da Lai e Jin che dimostrano la differenziazione delle cellule staminali embrionali murine (EScs) verso un’identità epiteliale timomica28, diversi studi hanno sviluppato e ottimizzato protocolli che descrivono la differenziazione diretta delle cellule iPS umane in un’identità TEP 21,24,25,26,27,29 . Questi studi portano alla differenziazione dei TEP che esprimono marcatori di identità epiteliale timica come FOXN1 e PAX9 24,25,28,30, così come di marcatori di funzionalità come DLL4 e AIRE26, ma privi di marcatori di maturazione TEC24,25. È stato dimostrato che due approcci supportano la maturazione dei TEP differenziati verso un’identità TEC matura: il trapianto in un modello in vivo come i topi29 e la riaggregazione in sistemi di organoidi timici 3D coltivati in un set-up di interfaccia aria-liquido21. Entrambi i sistemi hanno dimostrato il ruolo cruciale svolto dalla struttura 3D nel mantenere e supportare la maturazione di popolazioni funzionali di TEC in grado di supportare la linfopoiesi T in vivo o in vitro 15,24,25,31. Per il sistema di organoidi timici utilizzato in questo studio, condurre la differenziazione delle cellule iPS verso un’identità TEP seguendo un protocollo sviluppato e dettagliato in Provin et al.23. 2. Isolamento di ETP primari da un campione di timo pediatrico NOTA: Gli ETP sono progenitori originati dal midollo osseo che danno origine alla linea delle cellule T e alle cellule dendritiche all’interno del timo e mostrano il seguente fenotipo: CD3- CD4- CD8- CD14- CD19- CD56- CD45+ CD34+ CD7+32,33. Preparazione delle perle di esaurimentoIl giorno prima, trasferire le perle di isolamento delle celle magnetiche (Tabella dei materiali) in una provetta da 15 mL e lavare con 4 mL di tampone di isolamento (PBS + 0,1% BSA + 2 mM EDTA). Posizionare la provetta nel supporto magnetico, rimuovere il surnatante e aggiungere 2 ml di tampone di isolamento. Aggiungere anticorpi CD3, CD4 e CD8 di topo alle perle e incubare per 45 minuti a 4 °C sotto agitazione. Posizionare la provetta nel supporto magnetico, lavarla più volte in un tampone di isolamento e risospenderla in 20 mL di tampone di isolamento. Dissociazione del campione di timoTrasferire campioni di timo fresco in una capsula di Petri riempita con RPMI1640 (Tabella dei materiali). Tagliarlo con forbici e pinze sterili per dissezione in pezzi di circa 1 mme 3 di dimensione. Con una pipetta da 25 ml, sciacquare più volte il terreno e i frammenti (il terreno deve diventare torbido), quindi lasciare sedimentare i frammenti e raccogliere metà del terreno in una provetta da 50 ml. Aggiungere altro terreno e ripetere fino a quando il terreno rimane chiaro. Raccogliere il terreno in tutte le provette da 50 mL necessarie e centrifugare le provette a 200 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet in 10 mL di soluzione di lisi dei globuli rossi (Tabella dei materiali). Incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti e aggiungere 20 mL di tampone di lavaggio (PBS + 0,5% BSA + 4 mM EDTA + 1% penicillina/streptomicina). Centrifugare a 200 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere i pellet in 10 mL di tampone di lavaggio, filtrare attraverso un filtro a rete da 70 μm e contare le cellule. Arricchimento ETPDopo aver contato le cellule, regolare il volume a 10 mL per provetta con il tampone di lavaggio. Aggiungere la quantità necessaria di microsfere di isolamento cellulare (per 200 milioni di cellule, utilizzare 500 μL di perle in 20 mL di tampone di isolamento) e incubare a 4 °C sotto agitazione per 30 minuti. Posizionare il tubo sul supporto magnetico per 2 minuti e raccogliere con cura il surnatante in un tubo pulito. Rimuovere la provetta e pulire le perle con 20 ml di tampone isolante. Agitare il tubo, riposizionarlo sul supporto magnetico e raccogliere il surnatante. Ripetere questo passaggio due volte. Centrifugare i surnatanti a 200 x g per 5 min. Risospendere i pellet in 2 mL di tampone di isolamento e contare le cellule. Isolamento ETPRegolare la concentrazione a 200 milioni di cellule per mL e raccogliere un piccolo volume come controllo non colorato. Etichettare le cellule con anticorpi di topo anti-umano (Lin) (CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD56), CD7 e CD34 (utilizzare lo stesso fluorocromo per tutti i marcatori Lin). Incubare a 4 °C per 45 min. Lavare le celle in un volume uguale di tampone di lavaggio. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti, risospendere il pellet in 1 mL e contare le cellule. Regolare il volume a una concentrazione di 50 milioni di cellule per mL e filtrare le cellule attraverso un filtro a rete da 70 μm. Aggiungere il marcatore di vitalità preferito e selezionare le cellule Lin-CD34+ CD7+ viventi mediante citometria a flusso utilizzando un ugello da 70 μm. 3. 3D coltura di organoidi timici Preparazione TEPImmediatamente dopo l’isolamento dell’ETP, controllare la qualità della coltura TEP nei giorni 13-15. Assicurarsi che le celle raggiungano la confluenza e formino un monostrato denso con rigonfiamenti (Figura 1). Per raccogliere i TEP differenziati, lavare le cellule con DPBS-/-, rimuoverlo, aggiungere 1 mL di TrypLE (Table of Materials) per pozzetto e incubare a 37 °C per 5-7 minuti. Aggiungere 1 mL di XVIVO10 (Tabella dei materiali) per pozzetto, sciacquare più volte per staccare le cellule, trasferire in una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 1 mL di XVIVO10 e contare le cellule.NOTA: Per valutare in anticipo l’efficacia della differenziazione, utilizzare un pozzetto di coltura separatamente e verificare l’espressione di FOXN1 e PAX9 mediante RT-qPCR e la resa di differenziazione mediante citometria a flusso (calcolata come frazione di cellule EPCAM+ CD205+, che dovrebbe essere superiore al 50%) (Figura 1). In questa fase del differenziamento, quasi tutte le cellule EPCAM+ sono positive anche per CD205, attestando la loro identità precursore11. Preparazione ETPImmediatamente dopo l’isolamento dell’ETP, centrifugare la provetta di raccolta a 200 x g per 5 minuti. Risospendere il pellet in 1 mL di XVIVO10 e contare le cellule. Aggregazione di organoidi timiciPipettare i volumi adatti e raggruppare entrambe le sospensioni cellulari a una concentrazione di 2.00.000 TEP e 40.000 ETP per mL, pipettare delicatamente su e giù una volta per omogeneizzare. Aggiungere gli integratori adatti secondo la Tabella 1 e piastra 100 μl di sospensione cellulare mista per pozzetto in piastre a 96 pozzetti con fondo a U a basso legame. Utilizzare una pipetta multicanale per aumentare la produzione; Tuttavia, una classica pipetta monopunta limita la perdita di volumi di cellule preziose. Incubare le piastre a 37 °C e 5% di CO2 per una notte. Preparazione degli idrogelNOTA: La configurazione sperimentale utilizzata per la formazione di idrogel, la semina degli organoidi e la distribuzione del terreno di coltura è mostrata nella Figura 2.Il giorno successivo (giorno 1 della fase di coltura degli organoidi), scongelare le aliquote di trombina (10 U/mL), aprotinina (26.000 U/mL) e fibrinogeno (8 mg/mL) (Tabella dei materiali). Scongelare la trombina e l’aprotinina con ghiaccio e il fibrinogeno in un bagno d’acqua a 37 °C (non metterlo in ghiaccio, poiché precipiterà). Non vortice, ma posizionare le aliquote sotto il cofano e omogeneizzarle con un pipettaggio delicato. Preparare tutti gli inserti sospesi necessari per il numero di organoidi prodotti seguendo i rapporti presentati nella Tabella 2. Posizionare gli inserti nei pozzetti di coltura utilizzando una pinza sterile e lasciare almeno una colonna o una riga vuota nella piastra di coltura. Preparare tante provette da 1,5 ml quanti sono i gel da colare. In ogni provetta, pipettare prima i volumi necessari di Fibrinogeno e Aprotinina come descritto nella Tabella 2. In un secondo momento, aggiungere il volume di trombina richiesto in una singola provetta, lavare rapidamente 2 volte senza creare bolle per omogeneizzare i reagenti, quindi aspirare l’intero contenuto della provetta e lavare rapidamente la miscela nell’inserto sospeso. Posizionare la pipetta verticalmente sopra il centro dell’inserto e sciacquare delicatamente la miscela di reagenti senza generare bolle.NOTA: In questa fase, la velocità di esecuzione è fondamentale in quanto i reagenti polimerizzeranno in pochi secondi ed è importante mescolarli correttamente per evitare la formazione di grumi o densità irregolare nel gel. Procedere un pozzetto alla volta utilizzando una provetta da 1,5 ml diversa per ogni pozzetto (se una provetta viene riutilizzata per più pozzetti, i grumi di gel solido rimanenti potrebbero ostruire la punta della pipetta). Se la polimerizzazione avviene troppo rapidamente a causa dell’elevata attività della trombina, utilizzare una diluizione 1:2. Subito dopo la colata, i gel devono essere da trasparenti a leggermente traslucidi e continuare a fluire dopo alcuni secondi quando la piastra viene inclinata verticalmente. Incubare per almeno 1 ora a 37 °C fino a quando la soluzione trasparente non si solidifica e diventa di colore bianco opaco e i gel rimangono saldamente in posizione quando la piastra viene inclinata verticalmente (Figura 2A). Semina di organoidiVerificare la qualità del passaggio di aggregazione. Assicurarsi che le micromasse formino masse cellulari sferiche, con un nucleo compatto circondato da un alone di ETP a bassa densità (Figura 3). Tagliare la punta di un cono P200 e lavarlo con una soluzione antiaderente (Tabella dei materiali). Per raccogliere le masse cellulari, inclinare la piastra in una posizione quasi verticale: le micromasse affonderanno nella parete inferiore dei pozzetti e possono essere facilmente recuperate spingendo progressivamente la punta della pipetta sul fondo del pozzetto durante l’aspirazione. Seminare la massa nella parte superiore degli idrogel depositandoli delicatamente senza toccare il gel con la punta della pipetta, seguendo i rapporti presentati nella Tabella 1 (Figura 2B). Anche se gli organoidi sembrano fluttuare liberamente in questa fase, quando sono gonfi con il terreno di coltura, il gel si ammorbidisce e gli organoidi si annidano nello strato superiore. Controllare al microscopio che non sia rimasto alcun organoide nei pozzetti P96. Preparare il volume richiesto di terreno di coltura secondo la Tabella 1 e la Tabella 2 e, in ciascun pozzetto, aggiungere lentamente un quarto del volume nella parte superiore degli idrogel senza toccarli pipettandoli lungo le pareti dell’inserto e i restanti tre quarti sul fondo del pozzetto posizionando la pipetta tra i bracci dell’inserto sospeso (Figura 2C). Mettere 1 mL di PBS nei pozzetti di coltura vuoti per mantenere l’umidità nella piastra. Incubare a 37 °C e 5% CO2. Coltura di organoidi timiciIl giorno 2, controlla se gli organoidi sono ben seminati: gli idrogel devono essere rimasti in posizione e gli organoidi non devono essersi sedimentati sul fondo dell’inserto. Preparare la quantità necessaria di terreno di coltura seguendo la Tabella 1 e la Tabella 2. Rimuovere il terreno dirigendo la punta del cono di aspirazione tra i bracci dell’inserto sospeso, facendo attenzione a non toccare il gel. Aggiungere il nuovo terreno posizionando la pipetta nello stesso modo. Cambiare il fluido ogni 2 giorni, passando al mezzo di seconda fase (Tabella 1) dopo 2-4 giorni (il giorno 18 successivo all’inizio della differenziazione TEP).NOTA: Il lotto di organoidi può essere mantenuto in coltura in questo modo per un massimo di 6 settimane. Raccolta di organoidiPreparare una provetta da 15 mL con 1 mL di TrypLE per pozzetto da raccogliere. Tagliare la punta di un cono P1000 e rivestirla con una soluzione antiaderente. Pipettare delicatamente il gel posizionando il puntale della pipetta verticalmente al centro degli inserti (fare attenzione a non perforare la membrana) e trasferire nella provetta TrypLE. Lavare la membrana dell’inserto con TrypLE e trasferire anche nel tubo. Incubare a 37 °C per 15 minuti, agitando delicatamente a intervalli di 5 minuti. Assicurarsi che i gel e gli organoidi si dissocino. Dopo 15 minuti, filtrare su un filtro a rete da 70 μm e centrifugare a 200 x g per 5 minuti. Risospendere il pellet nel tampone di lavaggio e procedere con il metodo analitico prescelto.

Representative Results

Il flusso di lavoro del protocollo è riassunto nella Figura 4. Per questo modello 3D di coltura di organoidi, abbiamo adottato un idrogel di trombina e fibrinogeno che era stato precedentemente utilizzato dal nostro team per mantenere gli mTEC primari di topo per un paio di giorni, grazie ai segnali fisici e meccanici che forniva34. Dopo la polimerizzazione, il gel dovrebbe mostrare una struttura a maglie sciolta e spugnosa (Figura 5). Dopo la fase iniziale di semina e attaccamento, gli organoidi sono progressivamente cresciuti e si sono sviluppati sia in superficie che all’interno degli strati più alti del gel. A seconda delle proprietà del gel, delle condizioni di semina e del numero di organoidi seminati sul gel, gli organoidi formavano strutture da sferiche a oblunghe (Figura 6) e occasionalmente si fondevano per formare strutture più grandi. Due particolari sotto-livelli dell’organizzazione sono stati osservati all’interno degli organoidi dopo la prima settimana di coltura: in primo luogo, abbiamo osservato lunghe strutture simili a proiezioni sulla superficie cellulare formate da grandi cellule che si irradiano dagli organoidi e colonizzano l’idrogel in tutte le direzioni (Figura 6 e Figura 7). In secondo luogo, abbiamo osservato strutture simili a grappoli formate da cellule più piccole che si concentrano attorno a quelle proiezioni cellulari. Sebbene non siamo stati in grado di isolare entrambi i tipi di cellule per confermare l’ipotesi dello studio, questo fenomeno ricorda le disposizioni 3D che si trovano all’interno della corteccia timica, formate dall’interazione di singoli cTEC con un gran numero di cellule T in via di sviluppo molto più piccole, note come complessi di cellule nutrici timomiche11 (Figura 8). In diversi momenti durante la fase di coltura degli organoidi, abbiamo valutato la composizione cellulare degli organoidi timici mediante citometria a flusso e identificato diversi compartimenti chiave: TEC (caratterizzato come EPCAM+ CD45-), timociti (EPCAM- CD45+ CD3+) (Figura 9), nonché un compartimento EPCAM-CD45+ CD3- comprendente sottogruppi ematopoietici non timociti. Ulteriori dettagli possono essere trovati in Provin et al.23. Figura 1: Caratterizzazione della differenziazione da iPSC a TEP. (A) Esempio di differenziazione da iPSC a TEP a D13, microscopio a contrasto di fase invertito, 400x. Barra della scala: 500 μm. (B) Esempio di grafico a punti, la proporzione di cellule EPCAM+ tra le cellule DAPI- al giorno 14 di differenziazione, immagine da FlowJo 10.0.7. (C) Immunocolorazione contro DAPI (blu), PAX9 (rosso) e KRT8 (verde), immunofluorescenza e imaging confocale al giorno 16 della differenziazione da iPSC a TEP. Le frecce bianche indicano esempi di colorazione anti-PAX9. Barra della scala: 50 μm (D) Livello di espressione di FOXN1 (da RQ a GAPDH) durante la differenziazione da iPS a TEP. TEC: Riferimento di controllo positivo, TEC umani primari isolati da campioni di timo pediatrico. Grafico da Prism (GraphPad versione 8.0.1). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Configurazione sperimentale per la formazione di idrogel, la semina degli organoidi e la distribuzione del terreno di coltura. (A) Piastra di coltura con idrogel colati in inserti sospesi posizionati nelle file superiore e inferiore. (B) Semina dell’organoide: il cono della pipetta tagliato contenente 1 organoide viene posizionato sopra l’idrogel senza toccarlo e l’organoide viene delicatamente seminato sulla superficie del gel. (C) Il terreno di coltura viene depositato nel pozzetto di coltura posizionando la punta della pipetta tra i bracci dell’inserto sospeso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: D0 di coltura di organoidi timici prima della semina (giorni 13-15 del protocollo completo). (A) organoide prodotto con TEC derivati dalla linea Lon71.019 iPS. (B) Organoide prodotto con TEC derivati dalla linea MIPS203.003 iPS. Microscopio a contrasto di fase invertito, 1000x. Barre di scala: 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Rappresentazione riassuntiva di tutti i passaggi del protocollo. I campioni di timo pediatrico sono stati raccolti e dissociati e gli ETP primari Lin-CD34+ CD7+ sono stati ordinati mediante citometria a flusso. La differenziazione delle cellule iPS è stata condotta verso un’identità TEP. Gli ETP e i TEP derivati da iPS sono stati raggruppati e seminati in piastre a 96 pozzetti a basso legame e aggregati in organoidi timici durante la notte. Gli idrogel di fibrina sono stati preparati da aprotinina, fibrinogeno e trombina e fusi in inserti sospesi. Dopo la polimerizzazione, gli organoidi sono stati seminati sopra gli idrogel e il terreno di coltura di fase 1 è stato aggiunto ai pozzetti. Gli organoidi sono stati mantenuti in coltura per un massimo di 6 settimane. Creato in BioRender, licenza di pubblicazione AG26EFCZOM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Organizzazione e struttura dell’idrogel. Microscopio a contrasto di fase invertito, 1000x. Barra della scala: 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Organoidi maturi e struttura tridimensionale. (A) Organoide timico al giorno 24 di coltura 3D, linea MIPS203.003 iPS. (B) Immagine composita di un organoide timico al giorno 32 di coltura 3D, linea Lon71.019 iPS. Microscopio a contrasto di fase invertito. Barre di scala: 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Dettaglio della struttura degli organoidi timici. (A) Organoide timico al giorno 32 della coltura 3D, linea L71.019 iPS. (B) Organoide timico al giorno 27 della coltura 3D, linea L80.002 iPS. Microscopio a contrasto di fase invertito, 400x. Barre di scala: 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: Dettaglio della struttura di un organoide timico al 32° giorno di coltura 3D. Le frecce bianche indicano gruppi di piccoli timociti che proliferano in prossimità delle cellule TEC. Microscopio a contrasto di fase invertito, 400x. Barra della scala: 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 9: Proporzione del compartimento delle cellule T all’interno degli organoidi timici. (A) Esempio di dot plot, proporzione di cellule CD45+ CD3+ all’interno delle cellule viventi (DAPI-) negli organoidi timici al giorno 35 della coltura 3D, immagine da FlowJo 10.0.7. La frazione CD45+ CD3- comprende cellule ematopoietiche non timocitarie. (B) La proporzione di cellule CD45+ CD3+ all’interno di cellule viventi negli organoidi timici nei giorni 17, 24/25, 32 e 39/40 di coltura 3D, n=2 in duplicato tecnico o triplicato, grafico da Prism (GraphPad versione 8.0.1). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Unità Fase 1 media Dal giorno 14 al giorno 18 Fase 2 media Dal giorno 19 in poi Base XVIVO10 XVIVO10 BMP4 ng/mL 50 FGF8 ng/mL 10 FGF10 ng/mL 10 IGF1 ng/mL 10 FEG ng/mL 10 RANGO L ng/mL 50 50 IL7 ng/mL 5 5 FLT3 L ng/mL 5 5 SCF ng/mL 10 10 Glutamax ng/mL 1% 1% Tabella 1: Integratori e rispettive concentrazioni. Aprotinina (μL) Trombina (μL) Fibrinogeno (μL) Fase 1 medio Organoidi (unità) Piastra a 24 pozzetti 5 75 75 1 da 3 a 5 Piastra a 12 pozzetti 9.2 138.2 138.2 1.8 5 Piastra a 6 pozzetti 16 240.8 240.8 3.2 Da 8 a 9 Tabella 2: Rapporti richiesti dei componenti per la preparazione di idrogel e la semina di organoidi in piastre a 6, 12 e 24 pozzetti.

Discussion

Rispetto alla classica coltura monostrato in 2D o a modelli 3D all’avanguardia ancora più avanzati come RTOC (reaggregated thymus organ culture), il modello che descriviamo qui presenta miglioramenti significativi. Da un punto di vista tecnico, questo modello offre una migliore scalabilità e riproducibilità poiché i TEC derivano da celle iPS autorinnovanti. Consente inoltre l’editing genetico allo stadio iPSC per facilitare gli studi knock in o knock out nei TEC. La sopravvivenza degli organoidi timici mostrata in questo studio è notevole e fornisce un miglioramento significativo rispetto alle colture 2D o RTOC, con la dimostrazione della generazione di cellule T per un massimo di 6 settimane (Figura 9). Pertanto, la ricostituzione della struttura 3D timica e delle proprietà della ECM porta a una funzionalità timomica sostenuta nei nostri organoidi timici, ovvero la capacità di generare cellule T dal compartimento timocitario più maturo, emigranti timici recenti intorno alla settimana 4 della coltura 3D, con generazione di cellule T CD4+ e CD8+23.

Poiché il microambiente timico supporta un’intensa attività di espansione e differenziazione, il corretto scambio gassoso è un parametro cruciale in qualsiasi modello di timo in vitro. Infatti, risultati migliori sono stati osservati in modelli mantenuti in un’atmosfera arricchita di diossigeno o in interfacce aria-liquido21,35. Le nostre osservazioni supportano questo punto e sottolineano l’importanza di una corretta semina degli organoidi nella parte superiore dell’idrogel, appena sotto l’interfaccia dell’aria. I difetti di polimerizzazione che portano a idrogel viscosi o liquidi causeranno l’affondamento degli organoidi sul fondo degli inserti e ne ostacoleranno la crescita. La cocoltura con cellule endoteliali on-chip è un’alternativa promettente che potrebbe rompere questa barriera aggiungendo la vascolarizzazione. La dimensione degli organoidi di timo prodotti in questo studio è limitata a circa 5 mm, presumibilmente a causa della mancanza di scambi di gas e nutrienti nelle aree centrali. La vascolarizzazione consentirebbe quindi lo scale-up della coltura e, combinata con l’ottimizzazione del processo, consentirebbe la produzione di organoidi contenenti milioni di TEC e cellule T. Anche la densità dell’idrogel è un parametro cruciale e la sua riproducibilità tra i lotti è uno dei principali limiti del protocollo, data la sensibilità degli enzimi ai cicli di congelamento e scongelamento. La fase di colata dell’idrogel è una fase fondamentale del protocollo; Si consiglia di eseguire un test colando un idrogel 1 ora prima di qualsiasi esperimento pianificato per verificare l’attività del reagente. In caso di attività enzimatica insufficiente che porti a una polimerizzazione alterata e dato il costo dei TEP derivati da iPSC, non consigliamo altro rimedio che ricominciare il protocollo con aliquote di reagenti freschi. I TEC sono importanti produttori di ECM; Tuttavia, dati i recenti progressi nella comprensione del ruolo dei fibroblasti del timo, potrebbe essere interessante aggiungere una popolazione di fibroblasti irradiati nel modello di organoide. Questa popolazione potrebbe secernere fattori di crescita e ECM che parteciperebbero alla riproduzione dell’ambiente timico con effetti positivi sulla differenziazione e il mantenimento delle TEC e delle cellule T. Un altro importante limite di questo modello di organoide del timo è la mancanza di un’adeguata segregazione cortico-midollare. Poiché è stato dimostrato che i fibroblasti capsulari del timo modellano la formazione della corteccia, la loro aggiunta al modello di coltura potrebbe aiutare a risolvere questa limitazione. Pertanto, questo protocollo introduce le basi di complessi modelli in vitro del timo. Combina i recenti progressi compiuti nel campo della differenziazione timica delle iPSC, delle colture 3D a base di idrogel e della linfopoiesi in vitro. Questo modello può essere ulteriormente perfezionato per affrontare la scalabilità e aumentarne la complessità, ad esempio aggiungendo compartimenti mesenchimali e vascolari. Potrebbe quindi portare a preziose piattaforme di ricerca sull’immunità o applicazioni nella terapia cellulare personalizzata basata su cellule T.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vogliamo ringraziare i membri della struttura centrale iPSC di Nantes, in Francia, guidata da Laurent David. Questo lavoro è stato sostenuto dal programma JP-Rare Disease JTC2019 progetto TARID (EJPRD19-208) finanziato dall’ANR (ANR-19-RAR40011-5) a M.G. dalla sovvenzione RFI Bioregate (ThymIPS) della Région Pays de la Loire a M.G., dall’ANR (ANR-22-CE15-0045) a M.G. e dal progetto “SATT Ouest Valorisation” OrgaTreg a M.G. N.P. è stato sostenuto da “la fondation d’entreprise ProGreffe”. M.d.A. è stato sostenuto da “la Fondation pour la Recherche Médicale”. Ringraziamo la struttura iPSC di Nantes, supportata da IBiSA e Biogenouest, per l’utilizzo delle loro risorse e del loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal programma Labex IGO supportato dall’Agenzia Nazionale della Ricerca attraverso l’investimento del futuro programma ANR-11-LABX-0016-01.

Materials

Aprotinin Sigma Aldrich 616370
BMP4 Miltenyi 130-111-165
CCR7 (CD197) BD Biosciences PE Clone: 3D12; Dilution: 1: 200
CD14 BD Biosciences FITC Clone: M5E2; Dilution: 1: 200
CD19 BD Biosciences PE Clone: HIB19; Dilution: 1: 200
CD205 BioLegend FITC Clone: MG38; Dilution: 1: 200
CD3 BD Biosciences PE Clone: HIT3a; Dilution: 1: 200
CD34 BD Biosciences FITC Clone: 8G12; Dilution: 1: 100
CD4 BD Biosciences PE Clone: RPA-T4; Dilution: 1: 100
CD4 BD Biosciences BV711 Clone: L200; Dilution: 1: 200
CD45 BD Biosciences PerCP Clone: HI30; Dilution: 1: 200
CD56 BD Biosciences PE Clone: B159; Dilution: 1: 200
CD62L BD Biosciences BV605 Clone: DREG-56; Dilution: 1: 200
CD69 BD Biosciences BV510 Clone: FN50; Dilution: 1: 200
CD7 BD Biosciences APC Clone: M-T701; Dilution: 1: 200
CD8 BD Biosciences PeCy7 Clone: RPA-T8; Dilution: 1: 200
CD8 BD Biosciences PE Clone: HIT8a; Dilution: 1: 200
Dynabeads Pan Mouse IgG Invitrogen 11041
EGF Miltenyi 130-097-751
EPCAM (CD326) BD Biosciences PE Clone: HEA-125; Dilution: 1: 200
EPCAM (CD326) Miltenyi BV711 Clone: EBA-1; Dilution: 1: 200
FGF10 Miltenyi 130-127-858
FGF8 Biotechne R&D 423-F8
Fibrinogen Sigma Aldrich 341578
FLT3 L Peprotech AF-300-19
Glutamax Gibco 35050-61
IGF1 Miltenyi 130-093-886
IL7 Peprotech AF-200-07
RANK L Biotechne R&D 6449-TEC
Red blood cell lysis solution Miltenyi 130-094-183
RPMI1640 Gibco 11875093
SCF Peprotech AF-300-07
Thrombin Sigma Aldrich 605190
TrypLE Gibco 2605010
XVIVO10 Lonza LONBE04-380Q
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d’Arco, M., Provin, N., Maminirina, P., Baron, O., Guillonneau, C., David, L., Giraud, M. Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels. J. Vis. Exp. (212), e66795, doi:10.3791/66795 (2024).
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