Ici, nous décrivons un protocole pour la formation d’organoïdes de thymus humains dérivés d’iPSC cultivés dans des hydrogels de fibrine 3D visant à soutenir la maturation des cellules épithéliales thymiques (TEC) et le maintien prolongé, ainsi que la thymopoïèse in vitro.
La génération d’un répertoire de lymphocytes T fonctionnels et auto-tolérants est un processus complexe dépendant du microenvironnement thymique et, principalement, des propriétés de sa matrice extracellulaire (MEC). Les cellules épithéliales thymiques (TEC) sont cruciales dans la thymopoïèse, nourrissant et sélectionnant les cellules T en développement en filtrant les clones auto-réactifs. Il a été démontré empiriquement que les TEC sont particulièrement sensibles aux indices physiques et chimiques fournis par l’ECM et la culture cellulaire monocouche classique entraîne une perte rapide de fonctionnalité jusqu’à leur mort. En raison de cette maintenance délicate combinée à une relative rareté, et malgré les enjeux importants de la modélisation de la biologie du thymus in vitro, les modèles capables d’imiter fidèlement la niche TEC à l’échelle et dans le temps font encore défaut. Ici, nous décrivons la formation d’un modèle organoïde thymique humain multicellulaire, dans lequel le compartiment TEC est dérivé de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) et réagrégé avec des progéniteurs thymocytaires précoces primaires dans un hydrogel tridimensionnel (3D) à base de fibrine. Ce modèle répond aux besoins actuels d’un système de culture évolutif qui reproduit le microenvironnement thymique ex vivo et démontre sa fonctionnalité, c’est-à-dire sa capacité à produire des lymphocytes T et à soutenir la croissance des organoïdes du thymus pendant plusieurs semaines. Ainsi, nous proposons un modèle pratique in vitro de la fonctionnalité du thymus à travers des organoïdes dérivés d’iPSC qui bénéficierait à la recherche sur la biologie TEC et la génération de lymphocytes T ex vivo.
Le thymus est un organe lymphoïde primaire qui joue un rôle essentiel dans la génération d’un système immunitaire compétent et tolérant 1,2,3. Les progéniteurs thymiques précoces (ETP) migrent de la moelle osseuse vers le thymus, où ils se développent et se différencient en lymphocytes T fonctionnels 1,2,4,5. Ces processus sont médiés par une population spécialisée, les cellules épithéliales thymiques (TEC)2,6,7. Les TECs dérivent des progéniteurs épithéliales thymiques (TEPs)8,9 et comprennent les TEC corticaux (cTEC) et les TEC médullaires (mTEC) qui jouent des rôles spécifiques dans la création du microenvironnement 3D spécialisé nécessaire à la migration, à l’expansion et à la maturation des lymphocytes T. Les TECs interviennent dans le développement des lymphocytes T principalement en fournissant des facteurs de croissance et de différenciation 1,10,11 et en sélectionnant négativement les thymocytes non fonctionnels et non tolérants par la présentation d’auto-antigènes 5,7,12. Les interactions complexes entre les lymphocytes T en développement et les TECs jouent également un rôle central dans la maturation et l’organisation 3D des populations TEC dans un processus connu sous le nom de diaphonie thymique 1,11. Les interactions entre les populations cellulaires du thymus dépendent profondément du microenvironnement spécifique façonné par la matrice extracellulaire (MEC). La MEC thymique est dans un état de réciprocité dynamique avec les populations de cellules thymiques, impactant la régulation des gènes et étant constamment remodelée en retour par la sécrétion d’enzymes ou de protéines matricielles13. L’ECM influence les cellules en modifiant la biodisponibilité des facteurs de croissance et des cytokines, en dirigeant la signalisation par des récepteurs membranaires tels que les intégrines et en façonnant les cytosquelettes par des forces physiques14. Il a été démontré que les composants de l’ECM thymique, tels que les collagènes et la laminine, ont une grande affinité pour les facteurs de croissance TGFb et FGF, qui sont cruciaux pour le maintien des TEC et pour les fixer en formant des complexes. La plasticité de l’ECM thymique, le module d’élasticité et la densité jouent également un rôle crucial dans l’instruction du destin TEC et la formation de la compartimentation du thymus, qui est essentielle à sa fonctionnalité. Ces indices soulignent l’importance de prendre en compte l’ECM et sa structure 3D pour imiter le thymus ex vivo. Ce point est soutenu par le fait que les TEC primaires se dédifférencient rapidement, perdent leur fonctionnalité et finissent par mourir lorsqu’ils sont cultivés dans des configurations de culture cellulaire classiques 15,16,17.
Des modèles de culture ont été développés pour étendre les populations fonctionnelles de TEC à partir d’explants thymiques humains afin de conserver la structure de l’ECM et les indices cruciaux qu’elle fournit aux TEC 18,19,20. Ce système de culture a réussi à étendre et à maintenir une population de TEC fonctionnels in vitro, mais n’a pas pu être maintenu au-delà de 7 à 8 jours de culture18. Ainsi, le développement d’un système de culture 3D accessible, pratique et capable de reproduire le microenvironnement thymique et sa fonctionnalité in vitro et à long terme est un enjeu crucial sur le terrain. Récemment, le développement de systèmes de culture 3D à base d’hydrogel a conduit à l’émergence de plusieurs systèmes organoïdes thymiques artificiels, constituant une avancée majeure pour la modélisation thymique in vitro 15,16,21,22. Nous avons développé un système de co-culture d’organoïdes thymiques humains (hTO) par la réagrégation d’ETP primaires humains avec des TEP humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en sphéroïdes et leur ensemencement sur un hydrogel de fibrine.
Le choix du matériau et de la configuration de l’hydrogel dans cette étude visait à reproduire la structure native de l’ECM thymique tout en conservant l’aspect pratique et la possibilité d’étendre le processus pour obtenir une source de matériau abordable et abondante pour les expériences15. Ce système hTO présente un potentiel de différenciation multilignée et peut soutenir une thymopoïèse productive à partir d’ETP23. Ce système organoïde constitue un outil fiable pour l’étude des interactions cellulaires intrathymiques et la modélisation de la lymphopoïèse humaine normale et pathologique. L’utilisation de cellules iPS introduit également des capacités d’édition de gènes dans le modèle. La différenciation efficace de l’iPSC en tissu thymique fonctionnel est un objectif de longue date du domaine depuis 15 ans, et des progrès significatifs ont été réalisés dans le déchiffrage de la signalisation du destin de la lignée TEC 21,24,25,26,27. Pour répondre au besoin d’un tel modèle thymique 3D in vitro, cette note technique décrit les méthodes et les détails techniques pour la génération étape par étape d’organoïdes de thymus humains dérivés d’iPSC, en se concentrant sur la formation d’un échafaudage d’hydrogel, la réagrégation et l’ensemencement de la micromasse cellulaire, ainsi que la culture et la récolte d’organoïdes.
Par rapport à la culture monocouche classique en 2D ou à des modèles 3D de pointe encore plus avancés tels que la RTOC (culture d’organes de thymus réagrégés), le modèle que nous décrivons ici présente des améliorations significatives. D’un point de vue technique, ce modèle offre une évolutivité et une reproductibilité améliorées car les TEC sont dérivés de cellules iPS auto-renouvelables. Il permet également l’édition de gènes au stade iPSC pour des études plus faciles dans les TEC. La capacité de survie des organoïdes thymiques montrés dans cette étude est remarquable et fournit une amélioration significative par rapport aux cultures 2D ou RTOC, avec une génération de lymphocytes T démontrée jusqu’à 6 semaines (Figure 9). Ainsi, la reconstitution de la structure 3D thymique et des propriétés ECM conduit à une fonctionnalité thymique soutenue dans nos organoïdes thymiques, c’est-à-dire la capacité de générer des lymphocytes T à partir du compartiment thymocytaire le plus mature, émigrants thymiques récents vers la 4e semaine de culture 3D, avec génération de lymphocytes T CD4+ et CD8+23.
Parce que le microenvironnement thymique soutient une activité intense d’expansion et de différenciation, un bon échange gazeux est un paramètre crucial dans tout modèle de thymus in vitro. En effet, de meilleurs résultats ont été observés dans des modèles maintenus soit dans une atmosphère enrichie en dioxygène, soit à des interfaces air-liquide21,35. Nos observations confirment ce point et soulignent l’importance d’un ensemencement correct des organoïdes au sommet de l’hydrogel, juste sous l’interface aérienne. Des défauts de polymérisation conduisant à des hydrogels visqueux à liquides provoqueront l’enfoncement des organoïdes au fond des inserts et entraveront leur croissance. La coculture avec des cellules endothéliales sur puce est une alternative prometteuse qui pourrait briser cette barrière en ajoutant de la vascularisation. La taille des organoïdes du thymus produits dans cette étude est limitée à environ 5 mm, prétendument en raison d’un manque d’échanges de gaz et de nutriments dans les zones centrales. La vascularisation permettrait ainsi une mise à l’échelle de la culture et, combinée à l’optimisation des procédés, permettrait la production d’organoïdes contenant des millions de TEC et de lymphocytes T. La densité de l’hydrogel est également un paramètre crucial, et sa reproductibilité entre les lots est l’une des principales limites du protocole, compte tenu de la sensibilité des enzymes aux cycles de congélation et de décongélation. L’étape de coulée d’hydrogel est une étape critique du protocole ; Nous vous recommandons d’effectuer un test en coulant un hydrogel 1 h avant toute expérience prévue pour vérifier l’activité du réactif. En cas d’activité enzymatique insuffisante conduisant à une polymérisation altérée et compte tenu du coût des TEP dérivés d’iPSC, nous ne conseillons pas d’autre dépannage que de recommencer le protocole avec des aliquotes de réactifs frais. Les TEC sont d’importants producteurs d’ECM ; Cependant, compte tenu des avancées récentes dans la compréhension du rôle des fibroblastes thymiques, il pourrait être intéressant d’ajouter une population de fibroblastes irradiés dans le modèle organoïde. Cette population pourrait sécréter des facteurs de croissance et de MEC qui participeraient à la reproduction de l’environnement thymique avec des effets positifs sur la différenciation et le maintien des cellules TEC et T. Une autre limitation importante de ce modèle d’organoïde du thymus est l’absence de ségrégation cortico-médullaire appropriée. Étant donné qu’il a été démontré que les fibroblastes capsulaires du thymus façonnent la formation du cortex, leur ajout au modèle de culture pourrait aider à remédier à cette limitation. Ainsi, ce protocole introduit la base de modèles complexes in vitro du thymus. Il combine les avancées récentes réalisées dans les domaines de la différenciation thymique des iPSC, des cultures 3D à base d’hydrogel et de la lymphopoïèse in vitro. Ce modèle peut être affiné pour améliorer l’évolutivité et augmenter sa complexité, par exemple en ajoutant des compartiments mésenchymateux et vasculaires. Cela pourrait ainsi déboucher sur de précieuses plateformes de recherche sur l’immunité ou des applications dans la thérapie cellulaire personnalisée à base de cellules T.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier les membres de la plateforme iPSC de Nantes, en France, dirigée par Laurent David. Ce travail a été soutenu par le programme JP-Maladies Rares JTC2019 projet TARID (EJPRD19-208) financé par l’ANR (ANR-19-RAR40011-5) à M.G., par la subvention RFI Bioregate (ThymIPS) de la Région Pays de la Loire à M.G., par l’ANR (ANR-22-CE15-0045) à M.G. et le projet « SATT Ouest Valorisation » OrgaTreg à M.G. N.P. a été soutenu par la fondation d’entreprise ProGreffe. M.d.A. a été soutenu par la Fondation pour la Recherche Médicale. Nous remercions la plateforme iPSC de Nantes, soutenue par IBiSA et Biogenouest, pour l’utilisation de leurs ressources et de leur soutien technique. Ces travaux ont été partiellement financés par le programme Labex IGO soutenu par l’Agence Nationale de la Recherche via l’investissement du futur programme ANR-11-LABX-0016-01.
Aprotinin | Sigma Aldrich | 616370 | |
BMP4 | Miltenyi | 130-111-165 | |
CCR7 (CD197) | BD Biosciences | PE | Clone: 3D12; Dilution: 1: 200 |
CD14 | BD Biosciences | FITC | Clone: M5E2; Dilution: 1: 200 |
CD19 | BD Biosciences | PE | Clone: HIB19; Dilution: 1: 200 |
CD205 | BioLegend | FITC | Clone: MG38; Dilution: 1: 200 |
CD3 | BD Biosciences | PE | Clone: HIT3a; Dilution: 1: 200 |
CD34 | BD Biosciences | FITC | Clone: 8G12; Dilution: 1: 100 |
CD4 | BD Biosciences | PE | Clone: RPA-T4; Dilution: 1: 100 |
CD4 | BD Biosciences | BV711 | Clone: L200; Dilution: 1: 200 |
CD45 | BD Biosciences | PerCP | Clone: HI30; Dilution: 1: 200 |
CD56 | BD Biosciences | PE | Clone: B159; Dilution: 1: 200 |
CD62L | BD Biosciences | BV605 | Clone: DREG-56; Dilution: 1: 200 |
CD69 | BD Biosciences | BV510 | Clone: FN50; Dilution: 1: 200 |
CD7 | BD Biosciences | APC | Clone: M-T701; Dilution: 1: 200 |
CD8 | BD Biosciences | PeCy7 | Clone: RPA-T8; Dilution: 1: 200 |
CD8 | BD Biosciences | PE | Clone: HIT8a; Dilution: 1: 200 |
Dynabeads Pan Mouse IgG | Invitrogen | 11041 | |
EGF | Miltenyi | 130-097-751 | |
EPCAM (CD326) | BD Biosciences | PE | Clone: HEA-125; Dilution: 1: 200 |
EPCAM (CD326) | Miltenyi | BV711 | Clone: EBA-1; Dilution: 1: 200 |
FGF10 | Miltenyi | 130-127-858 | |
FGF8 | Biotechne R&D | 423-F8 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | 341578 | |
FLT3 L | Peprotech | AF-300-19 | |
Glutamax | Gibco | 35050-61 | |
IGF1 | Miltenyi | 130-093-886 | |
IL7 | Peprotech | AF-200-07 | |
RANK L | Biotechne R&D | 6449-TEC | |
Red blood cell lysis solution | Miltenyi | 130-094-183 | |
RPMI1640 | Gibco | 11875093 | |
SCF | Peprotech | AF-300-07 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | 605190 | |
TrypLE | Gibco | 2605010 | |
XVIVO10 | Lonza | LONBE04-380Q |