Aquí, describimos un protocolo para la formación de organoides de timo derivados de iPSC humanos cultivados en hidrogeles de fibrina 3D con el objetivo de apoyar la maduración y el mantenimiento prolongado de las células epiteliales tímicas (TEC), así como la timopoiesis in vitro.
La generación de un repertorio de linfocitos T funcionales y autotolerantes es un proceso complejo que depende del microambiente tímico y, principalmente, de las propiedades de su matriz extracelular (MEC). Las células epiteliales tímicas (TEC) son cruciales en la timopoiesis, nutriendo y seleccionando las células T en desarrollo mediante el filtrado de clones autorreactivos. Se ha demostrado empíricamente que los TEC son particularmente sensibles a las pistas físicas y químicas suministradas por el ECM y el cultivo celular monocapa clásico conduce a una rápida pérdida de funcionalidad hasta su muerte. Debido a este delicado mantenimiento combinado con una relativa rareza, y a pesar de lo mucho que está en juego en el modelado de la biología del timo in vitro, todavía faltan modelos capaces de imitar fielmente el nicho de TEC a escala y a lo largo del tiempo. Aquí, describimos la formación de un modelo de organoide tímico humano multicelular, en el que el compartimento TEC se deriva de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) y se vuelve a agregar con progenitores primarios de timocitos tempranos en un hidrogel tridimensional (3D) basado en fibrina. Este modelo responde a las necesidades actuales de un sistema de cultivo escalable que reproduzca el microambiente tímico ex vivo y demuestre funcionalidad, es decir, la capacidad de producir células T y apoyar el crecimiento de organoides del timo durante varias semanas. Por lo tanto, proponemos un modelo práctico in vitro de la funcionalidad del timo a través de organoides derivados de iPSC que beneficiaría la investigación sobre la biología de TEC y la generación de células T ex vivo.
El timo es un órgano linfoide primario que desempeña un papel esencial en la generación de un sistema inmunitario competente y tolerante 1,2,3. Los progenitores tímicos tempranos (ETP) migran de la médula ósea al timo, donde se expanden y se diferencian en células T funcionales 1,2,4,5. Esos procesos están mediados por una población especializada, las células epiteliales tímicas (TEC)2,6,7. Las TEC derivan de progenitores epiteliales tímicos (TET)8,9 y comprenden TEC corticales (cTEC) y METulares (mTEC) que desempeñan funciones específicas en la creación del microambiente 3D especializado necesario para la migración, expansión y maduración de las células T. Los TECs median el desarrollo de linfocitos T principalmente proporcionando factores de crecimiento y diferenciación 1,10,11 y seleccionando negativamente timocitos no funcionales y no tolerantes a través de la presentación de autoantígenos 5,7,12. Las complejas interacciones entre las células T en desarrollo y las TEC también juegan un papel central en la maduración y la organización 3D de las poblaciones TEC en un proceso conocido como diafonía tímica 1,11. Las interacciones entre las poblaciones celulares del timo dependen en gran medida del microambiente específico formado por la matriz extracelular (MEC). La MEC tímica se encuentra en un estado de reciprocidad dinámica con las poblaciones de células tímicas, lo que afecta a la regulación génica y se remodela constantemente a su vez por la secreción de enzimas o proteínas de la matriz13. La MEC influye en las células a través de la modificación de la biodisponibilidad de los factores de crecimiento y las citocinas, la señalización directa a través de receptores unidos a la membrana, como las integrinas, y la conformación de los citoesqueletos a través de fuerzas físicas14. Se ha demostrado que los componentes tímicos de la MEC, como los colágenos y la laminina, tienen una alta afinidad por los factores de crecimiento TGFb y FGF, que son cruciales para el mantenimiento de la TEC y para fijarlos mediante la formación de complejos. La plasticidad, el módulo elástico y la densidad de la ECM tímica también desempeñan un papel crucial en la instrucción del destino de la TEC y en la configuración de la compartimentación del timo, que es esencial para su funcionalidad. Estas pistas ponen de manifiesto la importancia de tener en cuenta la MEC y su estructura 3D para imitar el timo ex vivo. Este punto está respaldado por el hecho de que los TEC primarios se desdiferencian rápidamente, pierden su funcionalidad y finalmente mueren cuando se cultivan en configuraciones clásicas de cultivo celular 15,16,17.
Se han desarrollado modelos de cultivo para ampliar las poblaciones funcionales de TEC a partir de explantes tímicos humanos con el fin de conservar la estructura de la MEC y las pistas cruciales que proporciona a las TEC 18,19,20. Este sistema de cultivo fue capaz de expandirse y mantener con éxito una población de TECs funcionales in vitro, pero no pudo sostenerse más allá de 7 a 8 días de cultivo18. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema de cultivo 3D accesible y práctico capaz de reproducir el microambiente tímico y su funcionalidad in vitro y a largo plazo es una apuesta crucial en el campo. Recientemente, el desarrollo de sistemas de cultivo 3D basados en hidrogel ha llevado a la aparición de varios sistemas de organoides tímicos artificiales, constituyendo un gran avance para el modelado tímico in vitro 15,16,21,22. Desarrollamos un sistema de cocultivo de organoides tímicos humanos (hTO) a través de la reagregación de ETPs primarios humanos con TEPs humanos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en esferoides y su siembra sobre un hidrogel de fibrina.
La elección del material y la configuración del hidrogel en este estudio tuvo como objetivo reproducir la estructura nativa de la MEC tímica, manteniendo al mismo tiempo la practicidad y la capacidad de escalar el proceso para obtener una fuente de material asequible y abundante para los experimentos15. Este sistema hTO muestra potencial de diferenciación multilinaje y puede soportar una timopoiesis productiva a partir de ETPs23. Este sistema de organoides constituye una herramienta fiable para el estudio de las interacciones celulares intratímicas y el modelado de la linfopoiesis humana normal y patológica. El uso de células iPS también introduce capacidades de edición de genes en el modelo. La diferenciación efectiva de iPSC en tejido tímico funcional ha sido un objetivo de larga data del campo durante los últimos 15 años, y se han logrado avances significativos en el desciframiento de la señalización del destino del linaje TEC 21,24,25,26,27. Para responder a la necesidad de un modelo tímico 3D in vitro de este tipo, esta nota técnica describe los métodos y detalles técnicos para la generación paso a paso de organoides de timo humano derivados de iPSC, centrándose en la formación de andamios de hidrogel, la reagregación y siembra de micromasas celulares, y el cultivo y la cosecha de organoides.
En comparación con el cultivo monocapa clásico en 2D o incluso con modelos 3D de última generación más avanzados, como el RTOC (cultivo de órganos de timo reagregado), el modelo que describimos aquí presenta mejoras significativas. Desde un punto de vista técnico, este modelo ofrece una escalabilidad y reproducibilidad mejoradas, ya que los TEC se derivan de células iPS que se renuevan automáticamente. También permite la edición de genes en la etapa de iPSC para facilitar los estudios de knock in o knock out en TEC. La capacidad de supervivencia de los organoides tímicos mostrados en este estudio es notable y proporciona una mejora significativa en comparación con los cultivos 2D o RTOC, con una generación de células T demostrada durante hasta 6 semanas (Figura 9). Por lo tanto, la reconstitución de la estructura tímica 3D y las propiedades de la MEC conducen a una funcionalidad tímica sostenida en nuestros organoides tímicos, es decir, la capacidad de generar células T a partir del compartimento de timocitos más maduro, emigrantes tímicos recientes alrededor de la semana 4 de cultivo 3D, con generación de células T CD4+ y CD8+23.
Debido a que el microambiente tímico apoya una intensa actividad de expansión y diferenciación, el intercambio gaseoso adecuado es un parámetro crucial en cualquier modelo de timo in vitro. De hecho, se han observado mejores resultados en modelos mantenidos en una atmósfera de dioxígeno enriquecida o en interfaces aire-líquido21,35. Nuestras observaciones apoyan este punto y resaltan la importancia de una correcta siembra de organoides en la parte superior del hidrogel, justo debajo de la interfaz aérea. Los defectos en la polimerización que conducen a hidrogeles viscosos a líquidos causarán el hundimiento de organoides en la parte inferior de los insertos y obstaculizarán su crecimiento. El cocultivo con células endoteliales on-chip es una alternativa prometedora que podría romper esta barrera añadiendo vascularización. El tamaño de los organoides del timo producidos en este estudio se limita a alrededor de 5 mm, supuestamente debido a la falta de intercambios de gases y nutrientes en las áreas centrales. Por lo tanto, la vascularización permitiría el escalado del cultivo y, combinada con la optimización del proceso, permitiría la producción de organoides que contienen millones de TEC y células T. La densidad del hidrogel también es un parámetro crucial, y su reproducibilidad en lotes es una de las principales limitaciones del protocolo, dada la sensibilidad de las enzimas a los ciclos de congelación y descongelación. El paso de fundición de hidrogel es un paso crítico en el protocolo; Recomendamos realizar una prueba lanzando un hidrogel 1 h antes de cualquier experimento planificado para comprobar la actividad de los reactivos. En caso de que la actividad enzimática sea insuficiente y se produzca un deterioro de la polimerización y dado el coste de los TEP derivados de iPSC, no aconsejamos solucionar ningún otro problema que volver a iniciar el protocolo con alícuotas de reactivos frescos. Los TEC son importantes productores de ECM; Sin embargo, dados los recientes avances en la comprensión del papel de los fibroblastos tímicos, podría ser interesante añadir una población de fibroblastos irradiados al modelo de organoide. Esta población podría segregar factores de crecimiento y MEC que participarían en la reproducción del ambiente tímico con efectos positivos en la diferenciación y mantenimiento de TEC y células T. Otra limitación importante de este modelo de organoide timo es la falta de una segregación corticomedular adecuada. Debido a que se ha demostrado que los fibroblastos capsulares del timo dan forma a la formación de la corteza, su adición al modelo de cultivo podría ayudar a abordar esta limitación. Así, este protocolo introduce las bases de modelos complejos in vitro del timo. Combina los avances recientes realizados en los campos de la diferenciación tímica de iPSC, los cultivos basados en hidrogel 3D y la linfopoyesis in vitro. Este modelo se puede refinar aún más para abordar la escalabilidad y aumentar su complejidad, por ejemplo, agregando compartimentos mesenquimales y vasculares. Por lo tanto, podría dar lugar a valiosas plataformas de investigación sobre inmunidad o aplicaciones en la terapia celular personalizada basada en células T.
The authors have nothing to disclose.
Queremos agradecer a los miembros de la instalación central de iPSC de Nantes, Francia, encabezada por Laurent David. Este trabajo ha sido financiado por el proyecto JTC2019 del programa JP-Rare Disease TARID (EJPRD19-208) financiado por la ANR (ANR-19-RAR40011-5) a M.G. por la subvención RFI Bioregate (ThymIPS) de la Région Pays de la Loire a M.G., por la ANR (ANR-22-CE15-0045) a M.G. y el proyecto “SATT Ouest Valorisation” OrgaTreg a M.G. N.P. fue apoyado por “la fondation d’entreprise ProGreffe”. M.d.A. fue apoyado por “la Fondation pour la Recherche Médicale”. Agradecemos a la instalación central de iPSC de Nantes, con el apoyo de IBiSA y Biogenouest, por el uso de sus recursos y soporte técnico. Este trabajo fue parcialmente financiado por el programa Labex IGO apoyado por la Agencia Nacional de Investigación a través de la inversión del programa futuro ANR-11-LABX-0016-01.
Aprotinin | Sigma Aldrich | 616370 | |
BMP4 | Miltenyi | 130-111-165 | |
CCR7 (CD197) | BD Biosciences | PE | Clone: 3D12; Dilution: 1: 200 |
CD14 | BD Biosciences | FITC | Clone: M5E2; Dilution: 1: 200 |
CD19 | BD Biosciences | PE | Clone: HIB19; Dilution: 1: 200 |
CD205 | BioLegend | FITC | Clone: MG38; Dilution: 1: 200 |
CD3 | BD Biosciences | PE | Clone: HIT3a; Dilution: 1: 200 |
CD34 | BD Biosciences | FITC | Clone: 8G12; Dilution: 1: 100 |
CD4 | BD Biosciences | PE | Clone: RPA-T4; Dilution: 1: 100 |
CD4 | BD Biosciences | BV711 | Clone: L200; Dilution: 1: 200 |
CD45 | BD Biosciences | PerCP | Clone: HI30; Dilution: 1: 200 |
CD56 | BD Biosciences | PE | Clone: B159; Dilution: 1: 200 |
CD62L | BD Biosciences | BV605 | Clone: DREG-56; Dilution: 1: 200 |
CD69 | BD Biosciences | BV510 | Clone: FN50; Dilution: 1: 200 |
CD7 | BD Biosciences | APC | Clone: M-T701; Dilution: 1: 200 |
CD8 | BD Biosciences | PeCy7 | Clone: RPA-T8; Dilution: 1: 200 |
CD8 | BD Biosciences | PE | Clone: HIT8a; Dilution: 1: 200 |
Dynabeads Pan Mouse IgG | Invitrogen | 11041 | |
EGF | Miltenyi | 130-097-751 | |
EPCAM (CD326) | BD Biosciences | PE | Clone: HEA-125; Dilution: 1: 200 |
EPCAM (CD326) | Miltenyi | BV711 | Clone: EBA-1; Dilution: 1: 200 |
FGF10 | Miltenyi | 130-127-858 | |
FGF8 | Biotechne R&D | 423-F8 | |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | 341578 | |
FLT3 L | Peprotech | AF-300-19 | |
Glutamax | Gibco | 35050-61 | |
IGF1 | Miltenyi | 130-093-886 | |
IL7 | Peprotech | AF-200-07 | |
RANK L | Biotechne R&D | 6449-TEC | |
Red blood cell lysis solution | Miltenyi | 130-094-183 | |
RPMI1640 | Gibco | 11875093 | |
SCF | Peprotech | AF-300-07 | |
Thrombin | Sigma Aldrich | 605190 | |
TrypLE | Gibco | 2605010 | |
XVIVO10 | Lonza | LONBE04-380Q |