JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Vorming van menselijke thymusorganoïden in driedimensionale fibrinehydrogels

Published: October 04, 2024
doi:
10.3791/66795
, , , , , ,
1Nantes Université, CHU Nantes, INSERM, Center for Research in Transplantation and Translational Immunology, UMR 1064, 2CHU Nantes, Nantes Université, Department of Pediatric and Congenital Cardiac Surgery, 3Nantes Université, CHU Nantes, INSERM, CNRS, BioCore, SFR Bonamy

Summary

Hier beschrijven we een protocol voor de vorming van humane iPSC-afgeleide thymusorganoïden gekweekt in 3D-fibrinehydrogels met als doel de rijping van thymusepitheelcellen (TEC) en langdurig onderhoud te ondersteunen, evenals thymopoëse in vitro.

Abstract

Het genereren van een functioneel en zelftolerant T-celrepertoire is een complex proces dat afhankelijk is van de micro-omgeving van de thymus en vooral van de eigenschappen van de extracellulaire matrix (ECM). Thymusepitheelcellen (TEC’s) zijn cruciaal bij thymopoëse, het voeden en selecteren van zich ontwikkelende T-cellen door zelfreactieve klonen te filteren. Het is empirisch aangetoond dat TEC’s bijzonder gevoelig zijn voor fysische en chemische aanwijzingen die door de ECM worden geleverd, en klassieke monolaagse celcultuur leidt tot een snel verlies van functionaliteit tot hun dood. Vanwege dit delicate onderhoud in combinatie met relatieve zeldzaamheid, en ondanks de hoge inzet bij het modelleren van thymusbiologie in vitro, ontbreken er nog steeds modellen die de TEC-niche op schaal en in de loop van de tijd getrouw kunnen nabootsen. Hier beschrijven we de vorming van een meercellig humaan thymus-organoïdemodel, waarin het TEC-compartiment is afgeleid van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) en opnieuw wordt geaggregeerd met primaire vroege thymocytenvoorlopercellen in een driedimensionale (3D) hydrogel op basis van fibrine. Dit model beantwoordt aan de huidige behoefte aan een schaalbaar kweeksysteem dat de thymus-micro-omgeving ex vivo reproduceert en functionaliteit aantoont, d.w.z. het vermogen om T-cellen te produceren en de groei van thymus-organoïden gedurende meerdere weken te ondersteunen. Daarom stellen we een praktisch in vitro model voor van de thymusfunctionaliteit door middel van iPSC-afgeleide organoïden dat onderzoek naar TEC-biologie en T-celgeneratie ex vivo ten goede zou komen.

Introduction

De thymus is een primair lymfoïde orgaan dat een essentiële rol speelt bij het genereren van een competent en tolerant immuunsysteem 1,2,3. Vroege thymusvoorlopercellen (ETP’s) migreren van het beenmerg naar de thymus, waar ze zich uitbreiden en differentiëren tot functionele T-cellen 1,2,4,5. Die processen worden gemedieerd door een gespecialiseerde populatie, de thymusepitheelcellen (TEC’s)2,6,7. TEC’s zijn afgeleid van thymusepitheliale voorlopercellen (TEP’s)8,9 en omvatten corticale TECs (cTEC’s) en medullaire TEC’s (mTEC’s) die een specifieke rol spelen bij het creëren van de gespecialiseerde 3D-micro-omgeving die nodig is voor de migratie, expansie en rijping van T-cellen. TEC’s mediëren de ontwikkeling van T-cellen voornamelijk door groei- en differentiatiefactoren 1,10,11 te leveren en door niet-functionele en niet-tolerante thymocyten negatief te selecteren door de presentatie van zelf-antigenen 5,7,12. De complexe interacties tussen zich ontwikkelende T-cellen en TEC’s spelen ook een centrale rol in de rijping en 3D-organisatie van de TEC-populaties in een proces dat bekend staat als thymische overspraak 1,11. Interacties tussen de celpopulaties van de thymus zijn sterk afhankelijk van de specifieke micro-omgeving die wordt gevormd door de extracellulaire matrix (ECM). De thymus-ECM bevindt zich in een staat van dynamische wederkerigheid met thymuscelpopulaties, beïnvloedt de genregulatie en wordt in ruil daarvoor voortdurend hervormd door de afscheiding van enzymen of matrixeiwitten13. De ECM beïnvloedt cellen door modificatie van de biologische beschikbaarheid van groeifactoren en cytokines, directe signalisatie via membraangebonden receptoren zoals integrinen, en door cytoskeletten vorm te geven door fysieke krachten14. Van thymus ECM-componenten, zoals collagenen en laminine, is aangetoond dat ze een hoge affiniteit hebben voor groeifactoren TGFb en FGF’s, die cruciaal zijn voor TEC-onderhoud en om ze te fixeren door complexen te vormen. Thymus ECM-plasticiteit, elastische modulus en dichtheid spelen ook een cruciale rol bij het instrueren van het lot van TEC en het vormgeven van de compartimentering van de thymus, wat essentieel is voor zijn functionaliteit. Deze aanwijzingen benadrukken hoe belangrijk het is om rekening te houden met de ECM en zijn 3D-structuur om de thymus ex vivo na te bootsen. Dit punt wordt ondersteund door het feit dat primaire TEC’s snel dedifferentiëren, hun functionaliteit verliezen en uiteindelijk afsterven wanneer ze worden gekweekt in klassieke celcultuuropstellingen 15,16,17.

Er zijn kweekmodellen ontwikkeld om functionele TEC-populaties uit menselijke thymus-explantaten uit te breiden om de structuur van de ECM en de cruciale aanwijzingen die het levert aan TEC’s 18,19,20 te behouden. Dit kweeksysteem was in staat om met succes een populatie van functionele TEC’s in vitro uit te breiden en te behouden, maar kon niet langer dan 7 tot 8 dagen cultuur18 worden volgehouden. De ontwikkeling van een toegankelijk, praktisch 3D-kweeksysteem dat in staat is om de thymus-micro-omgeving en de functionaliteit ervan in vitro en op lange termijn te reproduceren, is dus een cruciaal belang in het veld. Onlangs heeft de ontwikkeling van op hydrogel gebaseerde 3D-kweeksystemen geleid tot de opkomst van verschillende kunstmatige thymus-organoïdesystemen, die een grote vooruitgang vormen voor in vitro thymusmodellering 15,16,21,22. We ontwikkelden een humaan thymus organoïde (hTO) co-cultuursysteem door de heraggregatie van menselijke primaire ETP’s met menselijke TEP’s afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) tot sferoïden en hun zaaien op een fibrinehydrogel.

De materiaalkeuze en hydrogelopstelling in deze studie was gericht op het reproduceren van de natuurlijke structuur van de thymus-ECM met behoud van bruikbaarheid en de mogelijkheid om het proces op te schalen om een betaalbare en overvloedige materiaalbron voor experimenten te verkrijgen15. Dit hTo-systeem vertoont differentiatiepotentieel voor meerdere afstammingslijnen en kan een productieve thymopoiesis van ETP’s23 ondersteunen. Dit organoïde systeem vormt een betrouwbaar hulpmiddel voor de studie van intrathymische cellulaire interacties en de modellering van normale en pathologische menselijke lymfopoëse. Het gebruik van iPS-cellen introduceert ook mogelijkheden voor het bewerken van genen in het model. Effectieve differentiatie van iPSC in functioneel thymusweefsel is de afgelopen 15 jaar een al lang bestaand doel van het vakgebied geweest, en er is aanzienlijke vooruitgang geboekt met het ontcijferen van het lot van de TEC-afstammingslijn dat 21,24,25,26,27 signaleert. Om tegemoet te komen aan de behoefte aan een dergelijk in vitro 3D-thymisch model, beschrijft deze technische nota de methoden en technische details voor het stapsgewijs genereren van iPSC-afgeleide menselijke thymusorganoïden, met de nadruk op de vorming van hydrogelsteigers, heraggregatie en zaaien van celmicromassa’s, en organoïdecultuur en oogst.

Protocol

De hiPSC-lijn hiN.Fm.m.Lon71.019 werd gegenereerd uit mannelijke volwassen fibroblasten en geherprogrammeerd via mRNA-transfectie. De hiPSC-lijn hiN.Fm.f.Lon80.002 werd gegenereerd uit vrouwelijke volwassen fibroblasten en geherprogrammeerd via mRNA-transfectie. De hiPSC-lijn hiN.Fs.f.MIPS203.003 werd gegenereerd uit vrouwelijke volwassen fibroblasten en geherprogrammeerd via recombinante Sendai virale vectorinfectie. Alle mobiele lijnen werden verzorgd door het iPSC-platform van Nantes. Patiënten gaven geïnformeerde toestemming voor het gebruik van hun cellen voor onderzoeksdoeleinden (geanonimiseerde verzameling, Lonza, cat # CC-2511). Primaire ETP’s worden geïsoleerd door dissociatie van postnatale menselijke thymusmonsters die zijn verkregen als geanonimiseerd weggegooid afval van patiënten die dezelfde dag een pediatrische hartoperatie ondergaan in het ziekenhuis van Nantes (CHU Nantes), in overeenstemming met de Franse CODECOH-regelgeving onder verklaring DC-2017-2987. 1. Gerichte differentiatie van iPSC’s in de richting van een TEP-identiteit OPMERKING: Sinds de eerste werken gepubliceerd door Lai en Jin die de differentiatie van muizen embryonale stamcellen (EScs) naar een thymusepitheliale identiteit aantonen28, hebben verschillende onderzoeken protocollen ontwikkeld en geoptimaliseerd die de gerichte differentiatie van menselijke iPS-cellen naar een TEP-identiteit beschrijven 21,24,25,26,27,29. Deze studies leiden tot de differentiatie van TEP’s die thymusepitheliale identiteitsmarkers zoals FOXN1 en PAX9 24,25,28,30 tot expressie brengen, evenals functionaliteitsmarkers zoals DLL4 en AIRE26, maar zonder TEC-rijpingsmarkers24,25. Er is aangetoond dat twee benaderingen de rijping van de gedifferentieerde TEP’s tot een volwassen TEC-identiteit ondersteunen: transplantatie in een in vivo model zoals muizen29, en reaggregatie in 3D thymus-organoïdesystemen gekweekt in een lucht-vloeistofinterface-opstelling21. Beide systemen hebben de cruciale rol aangetoond die de 3D-structuur speelt bij het handhaven en ondersteunen van de rijping van functionele TEC-populaties die in vivo of in vitro T-lymfopoëse kunnen ondersteunen 15,24,25,31. Voor het thymus-organoïdesysteem dat in deze studie wordt gebruikt, voert u de differentiatie van iPS-cellen uit naar een TEP-identiteit volgens een protocol dat is ontwikkeld en gedetailleerd in Provin et al.23. 2. Isolatie van primaire ETP’s uit een pediatrisch thymusmonster OPMERKING: ETP’s zijn voorlopercellen die afkomstig zijn van beenmerg en aanleiding geven tot de T-cellijn en tot dendritische cellen in de thymus en die het volgende fenotype vertonen: CD3- CD4- CD8- CD14- CD19- CD56- CD45+ CD34+ CD7+32,33. Bereiding van de uitputtingskorrelsBreng de dag ervoor magnetische celisolatieparels (materiaaltabel) over in een tube van 15 ml en was ze met 4 ml isolatiebuffer (PBS + 0,1% BSA + 2 mM EDTA). Plaats de buis in de magnetische standaard, verwijder het supernatant en voeg 2 ml isolatiebuffer toe. Voeg anti-humane CD3-, CD4- en CD8-antilichamen van muizen toe aan de korrels en incubeer gedurende 45 minuten bij 4 °C onder agitatie. Plaats de buis in de magnetische standaard, was hem meerdere keren in de isolatiebuffer en resuspendeer hem in 20 ml isolatiebuffer. Dissociatie van thymusmonstersBreng verse thymusmonsters over in een petrischaaltje gevuld met RPMI1640 (Tabel met materialen). Knip het met een steriele dissectieschaar en tang in stukken van ongeveer 1 mm, 3 groot. Spoel het medium en de fragmenten meerdere keren met een pipet van 25 ml (het medium moet troebel worden), laat de fragmenten vervolgens bezinken en verzamel de helft van het medium in een buisje van 50 ml. Voeg meer medium toe en herhaal totdat het medium helder blijft. Verzamel het medium in zoveel buisjes van 50 ml als nodig is en draai de buisjes gedurende 5 minuten rond op 200 x g . Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellets in 10 ml lyse-oplossing voor rode bloedcellen (materiaaltabel). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) en voeg 20 ml wasbuffer toe (PBS + 0,5% BSA + 4 mM EDTA + 1% penicilline/streptomycine). Centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 x g en verwijder het bovenaanliggende. Resuspendeer de pellets in 10 ml wasbuffer, zeef door een gaasfilter van 70 μm en tel de cellen. ETP-verrijkingPas na het tellen van de cellen het volume aan tot 10 ml per tube met de wasbuffer. Voeg de benodigde hoeveelheid celisolatiekorrels toe (gebruik per 200 miljoen cellen 500 μL parels in 20 ml isolatiebuffer) en incubeer bij 4 °C onder agitatie gedurende 30 min. Plaats de tube 2 minuten op de magnetische standaard en verzamel het supernatans voorzichtig in een schone tube. Verwijder de tube en reinig de korrels met 20 ml isolatiebuffer. Draai de buis om, plaats hem terug op de magnetische standaard en verzamel de supernatant. Herhaal deze stap twee keer. Draai de supernatanten op 200 x g gedurende 5 min. Resuspendeer de pellets in 2 ml isolatiebuffer en tel de cellen. ETP-isolatiePas de concentratie aan tot 200 miljoen cellen per ml en verzamel een klein volume als ongekleurde controle. Label de cellen met anti-humane afstamming (Lin) van muizen (CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD56), CD7 en CD34 antilichamen (gebruik hetzelfde fluorochroom voor alle Lin-markers). Incubeer bij 4 °C gedurende 45 min. Was de cellen in een gelijk volume wasbuffer. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 200 x g , resuspendeer de pellet in 1 ml en tel de cellen. Stel het volume in op een concentratie van 50 miljoen cellen per ml en zeef de cellen door een gaasfilter van 70 μm. Voeg de levensvatbaarheidsmarker naar keuze toe en sorteer levende Lin-CD34+ CD7+-cellen door middel van flowcytometrie met behulp van een mondstuk van 70 μm. 3. 3D thymus organoïde cultuur TEP-voorbereidingControleer onmiddellijk na ETP-isolatie de kwaliteit van de TEP-cultuur op dag 13-15. Zorg ervoor dat de cellen samenvloeiing bereiken en een dichte monolaag met uitstulpingen vormen (Figuur 1). Om de gedifferentieerde TEP’s te oogsten, wast u de cellen met DPBS-/-, verwijdert u, voegt u 1 ml TrypLE (Tabel met materialen) per putje toe en incubeert u gedurende 5-7 minuten bij 37 °C. Voeg 1 ml XVIVO10 (materiaaltabel) per putje toe, spoel meerdere keren om de cellen los te maken, breng over naar een buis van 15 ml en draai gedurende 5 minuten op 200 x g . Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 1 ml XVIVO10 en tel de cellen.OPMERKING: Om de werkzaamheid van de differentiatie van tevoren te beoordelen, gebruikt u een goed gekweekte apart en verifieert u de expressie van FOXN1 en PAX9 door RT-qPCR en het differentiatierendement door flowcytometrie (berekend als de fractie van EPCAM+ CD205+-cellen, die meer dan 50% moet zijn) (Figuur 1). In dit stadium van differentiatie zijn bijna alle EPCAM+-cellen ook positief voor CD205, wat getuigt van hun voorloperidentiteit11. ETP-voorbereidingDraai de verzamelbuis onmiddellijk na ETP-isolatie gedurende 5 minuten rond op 200 x g . Resuspendeer de pellet in 1 ml XVIVO10 en tel de cellen. Aggregatie van thymusorganoïdenPipeteer de geschikte volumes en bundel beide celsuspensies in een concentratie van 2,00,000 TEP en 40,000 ETP per ml, pipetteer voorzichtig één keer op en neer om te homogeniseren. Voeg de geschikte supplementen volgens tabel 1 toe en plaat 100 μl van de gemengde celsuspensie per putje in laagbindende U-bodem 96-putjes platen. Gebruik een meerkanaalspipet voor een betere output; Een klassieke pipet met één punt beperkt echter het verlies van volumes van kostbare cellen. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C en 5% CO2 . Bereiding van de hydrogelsOPMERKING: De experimentele opstelling die wordt gebruikt voor de vorming van hydrogel, het zaaien van organoïden en de distributie van kweekmedia wordt weergegeven in figuur 2.De volgende dag (dag 1 van de organoïdekweekfase) ontdooien aliquots van trombine (10 E/ml), aprotinine (26.000 E/ml) en fibrinogeen (8 mg/ml) (Materiaaltabel). Ontdooi de trombine en aprotinine op ijs en het fibrinogeen in een waterbad van 37 °C (leg het niet op ijs, want dan slaat het neer). Niet vortexen, maar de aliquots onder de motorkap plaatsen en ze homogeniseren door voorzichtig te pipetteren. Bereid zoveel hangende inzetstukken voor als nodig is voor het aantal geproduceerde organoïden volgens de verhoudingen in tabel 2. Plaats de inzetstukken met een steriele tang in de kweekkuiltjes en laat ten minste één kolom of rij leeg op de kweekplaat. Bereid zoveel tubes van 1,5 ml als gels voor om te gieten. Pipetteer in elk buisje eerst de benodigde hoeveelheden fibrinogeen en aprotinine zoals beschreven in tabel 2. Voeg in een tweede keer het vereiste trombinevolume toe aan een enkele buis, spoel snel 2 keer zonder luchtbellen te creëren om de reagentia te homogeniseren, zuig vervolgens de volledige inhoud van de buis op en spoel het mengsel snel in het hangende inzetstuk. Plaats de pipet verticaal boven het midden van de inzetstuk en spoel het reagensmengsel voorzichtig door zonder luchtbellen te genereren.OPMERKING: Bij deze stap is de snelheid van uitvoering cruciaal, aangezien reagentia binnen enkele seconden polymeriseren, en het is belangrijk om ze correct te mengen om de vorming van klonten of een ongelijkmatige dichtheid in de gel te voorkomen. Ga één putje per keer te werk met een ander buisje van 1,5 ml voor elk putje (als een buisje voor meerdere putjes wordt hergebruikt, kunnen de resterende vaste gelklontjes de punt van de pipet blokkeren). Als de polymerisatie te snel optreedt door de hoge activiteit van de trombine, gebruik dan een verdunning van 1:2. Vlak na het gieten moeten de gels transparant tot licht doorschijnend zijn en na enkele seconden nog vloeien wanneer de plaat verticaal wordt gekanteld. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C tot de transparante oplossing stolt en ondoorzichtig wit wordt, en de gels stevig op hun plaats blijven wanneer de plaat verticaal wordt gekanteld (Figuur 2A). Organoïde zaaienControleer de kwaliteit van de aggregatiestap. Zorg ervoor dat de micromassa’s sferische celmassa’s vormen, met een compacte kern omgeven door een halo van ETP’s met een lagere dichtheid (Figuur 3). Snijd de punt van een P200-kegel af en was deze met een antikleefoplossing (Materiaaltabel). Om de celmassa’s te oogsten, kantelt u de plaat naar een bijna verticale positie: de micromassa’s zinken naar de inferieure wand van de putjes en kunnen gemakkelijk worden teruggewonnen door de pipetpunt tijdens het opzuigen geleidelijk naar de bodem van het putje te duwen. Zaai de massa aan de bovenkant van de hydrogels door ze voorzichtig af te zetten zonder de gel met de pipetpunt aan te raken, volgens de verhoudingen in tabel 1 (figuur 2B). Zelfs als organoïden in dit stadium vrij lijken te zweven, zal de gel zachter worden wanneer ze worden opgezwollen met kweekmedium en zullen de organoïden zich nestelen in de bovenste laag. Controleer onder de microscoop of er geen organoïde meer in de P96-putjes zit. Bereid het vereiste volume kweekmedium voor volgens tabel 1 en tabel 2, en voeg in elk putje langzaam een kwart van het volume aan de bovenkant van de hydrogels toe zonder ze aan te raken door langs de wanden van het inzetstuk te pipetteren en het resterende driekwart op de bodem van het putje door de pipet tussen de armen van het hangende inzetstuk te plaatsen (Figuur 2C). Doe 1 ml PBS in de lege kweekputjes om de vochtigheid in de plaat op peil te houden. Incuberen bij 37 °C en 5% CO2 . Thymus organoïde cultuurControleer op dag 2 of de organoïden goed gezaaid zijn: de hydrogels moeten op hun plaats zijn gebleven en de organoïden mogen niet op de bodem van het inzetstuk zijn bezinkt. Bereid de benodigde hoeveelheid kweekmedium voor volgens tabel 1 en tabel 2. Verwijder het medium door de punt van de aspiratiekegel tussen de armen van het hangende inzetstuk te richten en zorg ervoor dat u de gel niet aanraakt. Voeg het nieuwe medium toe door de pipet op dezelfde manier te positioneren. Vervang het medium elke 2 dagen en schakel na 2 tot 4 dagen over naar het medium van de tweede fase (tabel 1) (op dag 18 na het begin van de TEP-differentiatie).OPMERKING: De batch organoïden kan op deze manier maximaal 6 weken in cultuur worden gehouden. Oogsten van organoïdenBereid een tube van 15 ml met 1 ml TrypLE per putje voor om te oogsten. Snijd de punt van een P1000-kegel af en smeer deze in met een anti-kleefoplossing. Pipetteer de gel voorzichtig door de pipetpunt verticaal in het midden van de inzetstukken te plaatsen (pas op dat u het membraan niet perforeert) en breng over naar de TrypLE-buis. Was het membraan van het inzetstuk met TrypLE en breng het ook over naar de buis. Incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten en draai zachtjes met tussenpozen van 5 minuten. Zorg ervoor dat de gels en organoïden dissociëren. Zeef na 15 minuten op een gaasfilter van 70 μm en centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 x g . Resuspendeer de pellet in de wasbuffer en ga verder met de analysemethode naar keuze.

Representative Results

De workflow van het protocol is samengevat in figuur 4. Voor dit 3D-organoïdecultuurmodel hebben we een trombine- en fibrinogeenhydrogel gebruikt die eerder door ons team was gebruikt om primaire mTEC’s van muizen een paar dagen te onderhouden, dankzij de fysieke en mechanische signalen die het leverde34. Na polymerisatie moet de gel een losse, sponsachtige gaasstructuur vertonen (Figuur 5). Na de eerste zaai- en aanhechtingsfase groeiden en ontwikkelden de organoïden zich geleidelijk, zowel aan het oppervlak als in de bovenste lagen van de gel. Afhankelijk van de eigenschappen van de gel, de zaaiomstandigheden en het aantal organoïden dat op de gel werd gezaaid, vormden de organoïden bolvormige tot langwerpige structuren (Figuur 6) en smolten ze af en toe samen om grotere structuren te vormen. Twee specifieke subniveaus van de organisatie werden waargenomen binnen de organoïden na de eerste week van de kweek: eerst observeerden we lange, celoppervlak-projectie-achtige structuren gevormd door grote cellen die vanuit de organoïden bestraalden en de hydrogel in alle richtingen koloniseerden (Figuur 6 en Figuur 7). Ten tweede observeerden we clusterachtige structuren gevormd door kleinere cellen die zich rond die celprojecties concentreerden. Hoewel we niet in staat waren om beide celtypen te isoleren om de onderzoekshypothese te bevestigen, doet dit fenomeen denken aan 3D-arrangementen die worden aangetroffen in de thymuscortex, gevormd door de interactie van individuele cTEC’s met een groot aantal veel kleinere zich ontwikkelende T-cellen, bekend als thymusverpleegstercelcomplexen11 (Figuur 8). Op verschillende tijdstippen tijdens de organoïdekweekfase evalueerden we de cellulaire samenstelling van de thymusorganoïden door middel van flowcytometrie en identificeerden we verschillende belangrijke compartimenten: TEC (gekarakteriseerd als EPCAM+ CD45-), thymocyten (EPCAM-CD45+ CD3+) (Figuur 9), evenals een EPCAM-CD45+ CD3-compartiment bestaande uit thymus hematopoëtische niet-thymocytensubsets. Verdere details zijn te vinden in Provin et al.23. Figuur 1: Karakterisering van iPSC naar TEP-differentiatie. (A) Voorbeeld van iPSC-naar-TEP-differentiatie bij D13, omgekeerde fasecontrastmicroscoop, 400x. Schaalbalk: 500 μm. (B) Voorbeeld van een dotplot, de verhouding tussen EPCAM+-cellen en DAPI-cellen op dag 14 van de differentiatie, afbeelding van FlowJo 10.0.7. (C) Immunokleuring tegen DAPI (blauw), PAX9 (rood) en KRT8 (groen), immunofluorescentie en confocale beeldvorming op dag 16 van iPSC naar TEP-differentiatie. Witte pijlen wijzen naar voorbeelden van anti-PAX9-kleuring. Schaalbalk: 50 μm (D) Expressieniveau van FOXN1 (RQ naar GAPDH) tijdens iPS naar TEP-differentiatie. TEC: Referentie voor positieve controle, primaire menselijke TECs geïsoleerd uit pediatrische thymusmonsters. Grafiek van Prism (GraphPad versie 8.0.1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Experimentele opstelling voor hydrogelvorming, het zaaien van organoïden en de distributie van kweekmediums. (A) Kweekplaat met hydrogels gegoten in hangende inzetstukken geplaatst in de bovenste en onderste rijen. (B) Organoïde zaaien: de gesneden pipetkegel met 1 organoïde wordt boven de hydrogel geplaatst zonder deze aan te raken, en de organoïde wordt voorzichtig aan het oppervlak van de gel gezaaid. (C) Kweekmedium wordt in de kweekput gedeponeerd door de punt van de pipet tussen de armen van het ophanginzetstuk te plaatsen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: D0 van de thymus organoïdecultuur vóór het zaaien (dag 13-15 van het volledige protocol). (A) organoïde geproduceerd met TEC’s afgeleid van de Lon71.019 iPS-lijn. (B) Organoïde geproduceerd met TEC’s afgeleid van de MIPS203.003 iPS-lijn. Omgekeerde fase contrast microscoop, 1000x. Schaal balken: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Samengevatte weergave van alle stappen van het protocol. Pediatrische thymusmonsters werden verzameld en gedissocieerd, en primaire Lin-CD34+ CD7+ ETP’s werden gesorteerd door middel van flowcytometrie. Differentiatie van iPS-cellen werd uitgevoerd in de richting van een TEP-identiteit. ETP’s en iPS-afgeleide TEP’s werden samengevoegd en gezaaid in laagbindende platen met 96 putjes en ‘s nachts geaggregeerd tot thymische organoïden. Fibrine-hydrogels werden bereid uit aprotinine, fibrinogeen en trombine en gegoten in hangende inzetstukken. Na polymerisatie werden de organoïden bovenop de hydrogels gezaaid en werd het fase 1-kweekmedium aan de putjes toegevoegd. De organoïden werden maximaal 6 weken in cultuur gehouden. Gemaakt in BioRender, publicatielicentie AG26EFCZOM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Organisatie en structuur van de hydrogel. Omgekeerde fase contrast microscoop, 1000x. Schaalbalk: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Rijpe organoïden en driedimensionale structuur. (A) Thymus organoïde op dag 24 van de 3D-cultuur, MIPS203.003 iPS-lijn. (B) Samengesteld beeld van een thymus-organoïde op dag 32 van de 3D-cultuur, Lon71.019 iPS-lijn. Omgekeerde microscoop met fasecontrast. Schaal balken: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Structuurdetail van thymusorganoïden. (A) Thymusorganoïde op dag 32 van de 3D-cultuur, L71.019 iPS-lijn. (B) Thymus-organoïde op dag 27 van de 3D-cultuur, L80.002 iPS-lijn. Omgekeerde fase contrast microscoop, 400x. Schaal balken: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: Structuurdetail van een thymus organoïde op dag 32 van de 3D-cultuur. Witte pijlen wijzen naar clusters van kleine thymocyten die zich in de nabijheid van TEC-cellen vermenigvuldigen. Omgekeerde fase contrast microscoop, 400x. Schaalbalk: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 9: Aandeel van het T-celcompartiment in thymusorganoïden. (A) Dot plot voorbeeld, aandeel van CD45+ CD3+ cellen in de levende (DAPI-) cellen in thymische organoïden op dag 35 van de 3D-kweek, afbeelding van FlowJo 10.0.7. De CD45+ CD3-fractie bestaat uit hematopoëtische niet-thymocytencellen. (B) Het aandeel CD45+ CD3+-cellen in levende cellen in thymusorganoïden op dag 17, 24/25, 32 en 39/40 van de 3D-cultuur, n=2 in technisch duplicaat of drievoud, grafiek van Prism (GraphPad versie 8.0.1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Eenheid Fase 1 medium Dag 14 tot Dag 18 Fase 2 middendag 19 en verder Base XVIVO10 XVIVO10 BMP4 NL ng/ml 50 FGF8 ng/ml 10 Bekijk materiaal FGF10 ng/ml 10 IGF1 ng/ml 10 EFG ng/ml 10 RANG L ng/ml 50 50 IL7 ng/ml 5 5 FLT3 L ng/ml 5 5 SCF ng/ml 10 10 Glutamax ng/ml 1% 1% Tabel 1: Supplementen en hun respectieve concentraties. Aprotinine (μL) Trombine (μL) Fibrinogeen (μL) Fase 1 medium Organoïden (eenheid) Plaat met 24 putjes 5 75 75 1 3 tot 5 Plaat met 12 putjes 9.2 138.2 138.2 1.8 5 Plaat met 6 putjes 16 240.8 240.8 3.2 8 tot 9 Tabel 2: Vereiste verhoudingen van componenten voor het bereiden van hydrogels en het zaaien van organoïden in platen met 6, 12 en 24 putjes.

Discussion

Vergeleken met klassieke monolaagcultuur in 2D of zelfs meer geavanceerde state-of-the-art 3D-modellen zoals RTOC (reaggregated thymus organ culture), biedt het model dat we hier beschrijven aanzienlijke verbeteringen. Vanuit technisch oogpunt biedt dit model een verbeterde schaalbaarheid en reproduceerbaarheid, aangezien TEC’s zijn afgeleid van zelfvernieuwende iPS-cellen. Het maakt ook genbewerking in de iPSC-fase mogelijk voor eenvoudigere knock-in- of knock-out-studies in TEC’s. De overlevingskansen van de thymusorganoïden die in deze studie worden getoond, is opmerkelijk en biedt een significante verbetering ten opzichte van 2D- of RTOC-culturen, met aangetoonde T-celgeneratie gedurende maximaal 6 weken (Figuur 9). De reconstitutie van de 3D-structuur van de thymus en de ECM-eigenschappen leidt dus tot een aanhoudende thymusfunctionaliteit in onze thymische organoïden, d.w.z. het vermogen om T-cellen te genereren uit het meest rijpe thymocytencompartiment, recente thymusemigranten rond week 4 van de 3D-cultuur, met aanmaak van zowel CD4+ als CD8+ T-cellen23.

Omdat de micro-omgeving van de thymus een intense expansie- en differentiatieactiviteit ondersteunt, is een goede gasuitwisseling een cruciale parameter in elk in vitro thymusmodel. Er zijn inderdaad verbeterde resultaten waargenomen in modellen die worden onderhouden in een verrijkte dioxydeatmosfeer of op lucht-vloeistofinterfaces21,35. Onze observaties ondersteunen dit punt en benadrukken het belang van een correcte organoïde zaaiing aan de bovenkant van de hydrogel net onder de luchtinterface. Defecten in de polymerisatie die leiden tot stroperige tot vloeibare hydrogels zullen ervoor zorgen dat organoïden op de bodem van de inzetstukken zinken en hun groei belemmeren. Cocultuur met endotheelcellen op de chip is een veelbelovend alternatief dat deze barrière zou kunnen doorbreken door vascularisatie toe te voegen. De grootte van de thymus-organoïden die in deze studie worden geproduceerd, is beperkt tot ongeveer 5 mm, naar verluidt als gevolg van een gebrek aan gas- en nutriëntenuitwisselingen in de kerngebieden. Vascularisatie zou dus opschaling van de cultuur mogelijk maken en, in combinatie met procesoptimalisatie, de productie van organoïden met miljoenen TEC’s en T-cellen mogelijk maken. De dichtheid van de hydrogel is ook een cruciale parameter, en de reproduceerbaarheid ervan in batches is een van de belangrijkste beperkingen van het protocol, gezien de gevoeligheid van de enzymen voor vries- en ontdooicycli. De stap van het hydrogelgieten is een cruciale stap in het protocol; We raden aan om 1 uur voor een gepland experiment een test uit te voeren door één hydrogel te gieten om de reagensactiviteit te controleren. In geval van onvoldoende enzymatische activiteit die leidt tot verminderde polymerisatie en gezien de kosten van de van iPSC afgeleide TEP’s, adviseren wij geen andere probleemoplossing dan het protocol opnieuw te starten met nieuwe reagentia aliquots. TEC’s zijn belangrijke producenten van ECM; Gezien de recente vooruitgang in het begrip van de rol van thymusfibroblasten, zou het echter interessant kunnen zijn om een populatie van bestraalde fibroblasten aan het organoïdemodel toe te voegen. Deze populatie zou groeifactoren en ECM kunnen afscheiden die zouden deelnemen aan de reproductie van de thymusomgeving met positieve effecten op de differentiatie en het onderhoud van TEC- en T-cellen. Een andere belangrijke beperking van dit thymus-organoïde model is het ontbreken van een goede cortico-medullaire segregatie. Omdat is aangetoond dat de kapselfibroblasten van de thymus de vorming van de cortex vormgeven, kan hun toevoeging aan het kweekmodel helpen deze beperking aan te pakken. Dit protocol introduceert dus de basis van complexe in vitro modellen van de thymus. Het combineert de recente ontwikkelingen op het gebied van iPSC-thymusdifferentiatie, 3D-hydrogel-gebaseerde culturen en in vitro lymfopoëse. Dit model kan verder worden verfijnd om de schaalbaarheid aan te pakken en de complexiteit ervan te vergroten, bijvoorbeeld door mesenchymale en vasculaire compartimenten toe te voegen. Het zou dus kunnen resulteren in waardevolle onderzoeksplatforms over immuniteit of toepassingen in gepersonaliseerde T-celgebaseerde celtherapie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen de leden van de iPSC-kernfaciliteit van Nantes, Frankrijk, onder leiding van Laurent David, bedanken. Dit werk werd ondersteund door het JP-Rare Disease JTC2019-programma TARID-project (EJPRD19-208) gefinancierd door de ANR (ANR-19-RAR40011-5) aan M.G. door de RFI Bioregate-subsidie (ThymIPS) van la Région Pays de la Loire aan M.G., door de ANR (ANR-22-CE15-0045) aan M.G. en het “SATT Ouest Valorisation” project OrgaTreg aan M.G. N.P. werd ondersteund door “la fondation d’entreprise ProGreffe”. M.d.A. werd gesteund door “la Fondation pour la Recherche Médicale”. We danken de iPSC-kernfaciliteit van Nantes, ondersteund door IBiSA en Biogenouest, voor het gebruik van hun middelen en technische ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het Labex IGO-programma, ondersteund door het National Research Agency via de investering van het toekomstige programma ANR-11-LABX-0016-01.

Materials

Aprotinin Sigma Aldrich 616370
BMP4 Miltenyi 130-111-165
CCR7 (CD197) BD Biosciences PE Clone: 3D12; Dilution: 1: 200
CD14 BD Biosciences FITC Clone: M5E2; Dilution: 1: 200
CD19 BD Biosciences PE Clone: HIB19; Dilution: 1: 200
CD205 BioLegend FITC Clone: MG38; Dilution: 1: 200
CD3 BD Biosciences PE Clone: HIT3a; Dilution: 1: 200
CD34 BD Biosciences FITC Clone: 8G12; Dilution: 1: 100
CD4 BD Biosciences PE Clone: RPA-T4; Dilution: 1: 100
CD4 BD Biosciences BV711 Clone: L200; Dilution: 1: 200
CD45 BD Biosciences PerCP Clone: HI30; Dilution: 1: 200
CD56 BD Biosciences PE Clone: B159; Dilution: 1: 200
CD62L BD Biosciences BV605 Clone: DREG-56; Dilution: 1: 200
CD69 BD Biosciences BV510 Clone: FN50; Dilution: 1: 200
CD7 BD Biosciences APC Clone: M-T701; Dilution: 1: 200
CD8 BD Biosciences PeCy7 Clone: RPA-T8; Dilution: 1: 200
CD8 BD Biosciences PE Clone: HIT8a; Dilution: 1: 200
Dynabeads Pan Mouse IgG Invitrogen 11041
EGF Miltenyi 130-097-751
EPCAM (CD326) BD Biosciences PE Clone: HEA-125; Dilution: 1: 200
EPCAM (CD326) Miltenyi BV711 Clone: EBA-1; Dilution: 1: 200
FGF10 Miltenyi 130-127-858
FGF8 Biotechne R&D 423-F8
Fibrinogen Sigma Aldrich 341578
FLT3 L Peprotech AF-300-19
Glutamax Gibco 35050-61
IGF1 Miltenyi 130-093-886
IL7 Peprotech AF-200-07
RANK L Biotechne R&D 6449-TEC
Red blood cell lysis solution Miltenyi 130-094-183
RPMI1640 Gibco 11875093
SCF Peprotech AF-300-07
Thrombin Sigma Aldrich 605190
TrypLE Gibco 2605010
XVIVO10 Lonza LONBE04-380Q
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  2. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11 (8), 666-673 (2010).
  3. Miller, J. F. A. P. The function of the thymus and its impact on modern medicine. Science. 369 (6503), (2020).
  4. Haddad, R., et al. Dynamics of thymus-colonizing cells during human development. Immunity. 24 (2), 217-230 (2006).
  5. Cumano, A., et al. New molecular insights into immune cell development. Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).
  6. Bautista, J. L., et al. Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla. Nat Commun. 12 (1), 1096 (2021).
  7. Kadouri, N., Nevo, S., Goldfarb, Y., Abramson, J. Thymic epithelial cell heterogeneity: TEC by TEC. Nat Rev Immunol. 20 (4), 239-253 (2020).
  8. Alves, N. L., et al. Serial progression of cortical and medullary thymic epithelial microenvironments. Eur J Immunol. 44 (1), 16-22 (2014).
  9. Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. L., Anderson, G., Jenkinson, W. E. Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors. Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).
  10. Tavian, M., Peault, B. Embryonic development of the human hematopoietic system. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 243-250 (2005).
  11. Abramson, J., Anderson, G. Thymic epithelial cells. Annu Rev Immunol. 35 (1), 85-118 (2017).
  12. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
  13. Sharma, H., Moroni, L. Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation. Adv Sci. 8 (14), 2100543 (2021).
  14. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci STKE. 2002 (119), 6 (2002).
  15. Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -. J., Boukamp, P., Kyewski, B. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).
  16. Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation. Biomaterials. 118, 1-15 (2017).
  17. Asnaghi, M. A., et al. Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells. Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747 (2021).
  18. Villegas, J. A., et al. Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality. Front Immunol. 9, 1663 (2018).
  19. Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla. Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).
  20. Campinoti, S., et al. Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds. Nat Commun. 11 (1), 6372 (2020).
  21. Ramos, S. A., et al. Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).
  22. Fan, Y., et al. Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts. Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).
  23. Provin, N., et al. Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development. bioRxiv. 2023, 572664 (2023).
  24. Parent, A. V., et al. Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development. Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).
  25. Sun, X., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo. Cell Stem Cell. 13 (2), 230-236 (2013).
  26. Inami, Y., et al. Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype. Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).
  27. Gras-Pena, R., et al. Human stem cell-derived thymic epithelial cells enhance human T cell development in a xenogeneic thymus. J Allergy Clin Immunol. 149 (5), 1755-1771 (2022).
  28. Lai, L., Jin, J. Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells. Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).
  29. Ramos, S. A., et al. Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells. J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).
  30. Provin, N., Giraud, M. Differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial cells and generation of thymic organoids: Applications for therapeutic strategies against APECED. Front Immunol. 13, 930963 (2022).
  31. Montel-Hagen, A., et al. In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells. Cell Rep. 33 (4), 108320 (2020).
  32. Park, J. -. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation. Science. 367 (6480), 3224 (2020).
  33. Flippe, L., et al. Rapid and reproducible differentiation of hematopoietic and T cell progenitors from pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 577464 (2020).
  34. Padonou, F., et al. Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium. EMBO Rep. 23 (3), e53576 (2022).
  35. Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis. Front Immunol. 12, 652665 (2021).

Tags

Thymus OrganoidsSelf-toleranceAutoimmunityThymic Epithelial CellsThymopoiesisCell TherapyAutoimmune DiseasesExtracellular MatrixInduced Pluripotent Stem CellsThree-dimensional HydrogelsThymocyte ProgenitorsMicroenvironment ModelingCellular CompositionOrgan TransplantationFunctional T Cell Repertoire

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
d’Arco, M., Provin, N., Maminirina, P., Baron, O., Guillonneau, C., David, L., Giraud, M. Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels. J. Vis. Exp. (212), e66795, doi:10.3791/66795 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image