三次元フィブリンハイドロゲルにおけるヒト胸腺オルガノイドの形成

hiPSC株hiN.Fm.m.Lon71.019は、成人の男性線維芽細胞から作製し、mRNAトランスフェクションによって再プログラムされました。hiPSC系統hiN.Fm.f.Lon80.002は、女性の成体線維芽細胞から作製し、mRNAトランスフェクションによって再プログラムされました。hiPSC系統hiN.Fs.f.MIPS203.003は、女性の成体線維芽細胞から作製され、組換え仙台ウイルスベクター感染によって再プログラムされました。すべての細胞株はNantes iPSCプラットフォームから提供されました。患者は、自分の細胞を研究目的で使用することについてインフォームドコンセントを与えました(匿名化コレクション、ロンザ、猫#CC-2511)。一次ETPは、同日にナント病院(CHU Nantes)で小児心臓手術を受けた患者から匿名化された廃棄廃棄物として得られた出生後のヒト胸腺サンプルを解離することにより、宣言DC-2017-2987に基づくフランスのCOCOH規制に準拠して分離されます。 1. iPS細胞のTEP同一性に向けた方向転換 注:LaiとJinが発表した最初の研究が、マウス胚性幹細胞(EScs)の胸腺上皮同一性28への分化を実証して以来、いくつかの研究が、ヒトiPS細胞のTEP同一性21,24,25,26,27,29への指向性分化を説明するプロトコルを開発し、最適化してきた.これらの研究は、FOXN1やPAX9などの胸腺上皮同一性マーカーを発現するTEPと、DLL4やAIREなどの機能性マーカーを発現するが、TEC成熟マーカー24,25を欠くTEPの分化につながる 24,25.分化したTEPの成熟したTEPの成熟性への成熟を支持する2つのアプローチが示されている:マウス29などのin vivoモデルへの移植と、気液界面セットアップ21で培われた3D胸腺オルガノイドシステムへの再凝集である。どちらのシステムも、in vivoまたはin vitroのTリンパポーシス15,24,25,31を支えることができる機能的なTEC集団の成熟を維持および支持する上で、3D構造が果たす重要な役割を実証しています。 この研究で使用した胸腺オルガノイドシステムでは、Provin et al.23で開発および詳述されているプロトコルに従って、iPS細胞のTEP同一性に向けた分化を行います。 2. 小児胸腺サンプルからの一次ETPの単離 注:ETPは、T細胞系統と胸腺内の樹状細胞を生じさせ、次の表現型を示す骨髄由来の前駆細胞です:CD3-CD4-CD8-CD14-CD19-CD56-CD45+ CD34+ CD7+32,33。 枯渇ビーズの調製前日、磁気細胞単離ビーズ(材料表)を15 mLチューブに移し、4 mLのアイソレーションバッファー(PBS + 0.1% BSA + 2 mM EDTA)で洗浄します。 チューブを磁気スタンドに入れ、上清を取り除き、2 mLのアイソレーションバッファーを加えます。 マウスの抗ヒトCD3、CD4、およびCD8抗体をビーズに添加し、撹拌下で4°Cで45分間インキュベートします。チューブをマグネットスタンドに置き、アイソレーションバッファーで数回洗浄し、20 mLのアイソレーションバッファーに再懸濁します。 胸腺サンプルの解離新鮮な胸腺サンプルをRPMI1640で満たされたシャーレに移します(材料の表)。滅菌解剖ハサミとペンチで約1mm3 の大きさに切ります。 25 mLピペットで培地とフラグメントを数回洗い流し(培地が濁るはずです)、フラグメントを沈殿させて培地の半分を50 mLチューブに集めます。メディウムをさらに追加し、メディウムが透明になるまで繰り返します。 培地を必要な数の50 mLチューブに集め、チューブを200 x g で5分間回転させます。 上清を取り除き、ペレットを10 mLの赤血球溶解液に再懸濁します(材料の表)。室温(RT)で5分間インキュベートし、20 mLの洗浄バッファー(PBS + 0.5% BSA + 4 mM EDTA + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン)を加えます。 200 x g で5分間遠心し、上清を取り除きます。ペレットを10 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、70 μmメッシュフィルターで濾過し、細胞をカウントします。 ETPエンリッチメント細胞をカウントした後、洗浄バッファーを使用してチューブあたり容量を10 mLに調整します。必要な量の細胞単離ビーズを添加し(2億個の細胞あたり、20mLの単離バッファーに500 μLのビーズを使用)、4°Cで30分間撹拌しながらインキュベートします。 チューブを磁気スタンドに2分間置き、上清をきれいなチューブに慎重に集めます。チューブを取り外し、20 mLのアイソレーションバッファーでビーズを洗浄します。チューブをボルテックスし、磁気スタンドに戻し、上清を収集します。この手順を 2 回繰り返します。 上清を200 x g で5分間回転させます。ペレットを2mLの分離バッファーに再懸濁し、細胞をカウントします。 ETPアイソレーション濃度を2億細胞/mLに調整し、未染色コントロールとして少量を回収します。 マウス抗ヒト系統(Lin)(CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD56)、CD7、およびCD34抗体(すべてのLinマーカーに同じ蛍光色素を使用)で細胞を標識します。4°Cで45分間インキュベートします。 等量の洗浄バッファーで細胞を洗浄します。細胞を200 x g で5分間回転させ、ペレットを1 mLに再懸濁し、細胞をカウントします。 容量を5,000万細胞/mLの濃度に調整し、70μmメッシュフィルターで細胞を濾します。 選択した生存率マーカーを添加し、70 μmノズルを使用したフローサイトメトリーにより、生きたLin-CD34+ CD7+細胞を選別します。 3. 3D胸腺オルガノイド培養 TEPの準備ETP単離の直後に、13〜15日目にTEP培養の品質を制御します。細胞がコンフルエンスに達し、膨らみのある密集した単層を形成することを確認します(図1)。 分化したTEPを回収するには、細胞をDPBS-/-で洗浄して除去し、ウェルごとに1 mLのTrypLE(Table of Materials)を加え、37°Cで5〜7分間インキュベートします。 ウェルあたり1 mLのXVIVO10(Table of Materials)を添加し、複数回フラッシュして細胞を剥離し、15 mLチューブに移し、200 x g で5分間遠心します。 上清を取り除き、ペレットを1mLのXVIVO10に再懸濁し、細胞をカウントします。注:分化の有効性を事前に評価するには、培養ウェルを別々に使用し、RT-qPCRによる FOXN1 と PAX9 の発現、およびフローサイトメトリーによる分化収量(EPCAM+ CD205+細胞の画分として計算され、50%以上である必要があります)を確認します(図1)。分化のこの段階では、ほぼすべてのEPCAM+細胞もCD205に対して陽性であり、その前駆体の同一性が証明されています11。 ETP準備ETP単離後すぐに、収集チューブを200 x g で5分間回転させます。ペレットを1mLのXVIVO10に再懸濁し、細胞をカウントします。 胸腺オルガノイドの凝集適切な容量をピペットで掌握し、両方の細胞懸濁液を1mLあたり2,00,000 TEPと40,000 ETPの濃度でプールし、一度ピペットで静かに上下させて均質化します。 表1に従って適切なサプリメントを添加し、低結合Uボトム96ウェルプレートに1ウェルあたり100μLの混合細胞懸濁液をプレート化します。マルチチャンネルピペットを使用して出力を増やします。しかし、従来のシングルチップピペットは、貴重な細胞の量の損失を制限します。プレートを37°Cおよび5%CO2で一晩インキュベートします。 ハイドロゲルの調製注:ヒドロゲル形成、オルガノイド播種、および培地の分配に使用される実験セットアップを 図2に示します。翌日(オルガノイド培養期の1日目)に、トロンビン(10 U/mL)、アプロチニン(26,000 U/mL)、フィブリノーゲン(8 mg/mL)のアリコートを解凍します(材料表)。トロンビンとアプロチニンを氷上で解凍し、フィブリノーゲンを37°Cの水浴で解凍します(沈殿するので氷の上に置いないでください)。ボルテックスではなく、アリコートをボンネットの下に置き、穏やかなピペッティングで均質化します。 表2に示す比率に従って、作製したオルガノイドの数に必要な数のハンギングインサートを準備します。滅菌ペンチを使用してインサートを培養ウェルにセットし、培養プレートに少なくとも1つの列または行を空にしておきます。 キャストするゲルと同じ数の1.5mLチューブを準備します。各チューブで、 まず表2に詳述されているように、必要量のフィブリノーゲンとアプロチニンをピペットで移します。 2回目には、必要な量のトロンビンを1本のチューブに加え、気泡を作らずに2回すばやく洗い流して試薬を均質化した後、チューブの内容物全体を引き出し、混合物を吊り下げインサートにすばやく洗い流します。ピペットをインサートの中央より上に垂直に置き、気泡を発生させずに試薬混合物を静かに洗い流します。注:このステップでは、試薬は数秒で重合するため、実行速度が重要であり、ゲル内の塊や密度の不均一の形成を避けるために、試薬を正しく混合することが重要です。ウェルごとに異なる1.5 mLチューブを使用して、一度に1ウェルずつ進めます(チューブを複数のウェルで再利用する場合、残っている固体ゲルの塊がピペットの先端を塞ぐ可能性があります)。トロンビンの活性が高いために重合が速すぎる場合は、1:2の希釈を使用してください。キャスティング直後のゲルは透明からわずかに半透明でなければならず、プレートを垂直に傾けると数秒後もまだ流れます。 透明溶液が固化して不透明な白に変わり、プレートを垂直に傾けたときにゲルがしっかりと固定されるまで、37°Cで少なくとも1時間インキュベートします(図2A)。 オルガノイド播種集計ステップの品質を確認します。マイクロマスが球状の細胞塊を形成し、コンパクトなコアが低密度のETPハローに囲まれていることを確認します(図3)。 P200コーンの先端を切り取り、付着防止液で洗います(材料表)。細胞塊を回収するには、プレートをほぼ垂直な位置に傾けます:マイクロ塊はウェルの下壁に沈み、吸引しながらピペットの先端をウェルの底に徐々に押すことで簡単に回復できます。 表1(図2B)に示されている比率に従って、ピペットチップでゲルに触れずにハイドロゲルを繊細に堆積することにより、ハイドロゲルの上部に塊を播種します。この段階ではオルガノイドが自由に浮いているように見えても、培地で膨潤させるとゲルが柔らかくなり、オルガノイドは上層に寄り添います。顕微鏡でP96ウェルにオルガノイドが残っていないことを確認します。 表1および表2に従って必要量の培地を調製し、各ウェルで、インサート壁に沿ってピペッティングすることにより、ハイドロゲルの上部に触れずに容量の4分の1をゆっくりと追加し、残りの4分の3をウェルの下部にピペットを吊り下げインサートのアームの間に配置して追加します(図2C)。 空の培養ウェルにPBS1 mLを入れて、プレート内の湿度を維持します。37°Cおよび5%CO2でインキュベートします。 胸腺オルガノイド培養2日目に、オルガノイドが十分に播種されているかどうかを確認します:ヒドロゲルが所定の位置に留まっていること、およびオルガノイドがインサートの底に沈殿していないこと。 表1および表2に従って、必要な量の培地を調製します。吸引コーンの先端を吊り下げインサートのアームの間に向け、ゲルに触れないようにして、培地を取り出します。同じ方法でピペットを配置して、新しい培地を追加します。 培地を2日ごとに交換し、2〜4日後(TEP分化開始後18日目)に第2相培地(表1)に切り替えます。注:オルガノイドバッチは、この方法で最大6週間培養に維持できます。 オルガノイドの収穫ウェルごとに1 mLのTrypLEが入った15 mLのチューブを調製して収穫します。 P1000コーンの先端をカットし、付着防止液でコーティングします。ピペットチップをインサートの中央に垂直に置いて(メンブレンに穴を開けないように注意して)、ゲルを優しくピペットで動かし、TrypLEチューブに移します。インサートのメンブレンをTrypLEで洗浄し、チューブにも移します。 37°Cで15分間インキュベートし、5分間隔で穏やかにボルテックスします。ゲルとオルガノイドが解離していることを確認します。 15分後、70 μmメッシュフィルターでひずみし、200 x g で5分間遠心します。ペレットを洗浄バッファーに再懸濁し、選択した分析法に進みます。