Выделение митохондрий для анализа митохондриального сверхкомплекса из образцов мелких тканей и клеточных культур

Суперкомплексы (СК) представляют собой супрамолекулярные ассоциации между отдельными комплексами дыхательной цепи ^1,2. Поскольку первоначальная идентификация СК и описание их состава по группе Шеггера ^2,3, в дальнейшем подтвержденные другими группами, было установлено, что они содержат дыхательные комплексы I, III и IV (CI, CIII и CIV соответственно) в разных стехиометриях. Можно выделить две основные популяции СК: содержащие ДИ (и либо только CIII, либо CIII и CIV) и с очень высокой молекулярной массой (MW, начиная с ~1,5 MDa для меньших SC: CI + CIII₂), и содержащие CIII и CIV, но не CIV, с гораздо меньшим размером (например, CIII₂ + CIV с ~680 кДа). Эти СК сосуществуют во внутренней митохондриальной мембране со свободными комплексами, также в разных пропорциях. Таким образом, в то время как CIV в основном встречается в ассоциированных с ним формах (то есть в SC: ~80% в сердце крупного рогатого скота и более 90% во многих типах клеток человека)³, CIV очень распространен в свободной форме (более 80% в сердце крупного рогатого скота), при этом CIII демонстрирует более сбалансированное распределение (~40% в более распространенной свободной форме, как димер, в бычьем сердце).

В то время как их существование в настоящее время общепризнано, их точная роль все еще обсуждается 4,5,6,7,8,9,10. Согласно модели пластичности, в зависимости от типа клеток или метаболического статуса могут существовать различные пропорции СК и отдельных комплексов ^1,7,11. Такая динамическая природа сборки позволит элементам регулировать использование доступного топлива и эффективность системы окислительного фосфорилирования (OXPHOS) в ответ на изменения окружающей среды ^4,5,7. СК также могут способствовать контролю скорости образования активных форм кислорода и участвовать в стабилизации и обороте отдельных комплексов 4,12,13,14. Описаны изменения статуса сборки СК в связи с различными физиологическими и патологическими ситуациями^15,16 и с процессом старения¹⁷.

Таким образом, изменения в паттернах SC были описаны у дрожжей в зависимости от источника углерода, используемого для роста², и в культивируемых клетках млекопитающих при замещении глюкозы галактозой⁴. Также сообщалось об изменениях в печени мышей после голодания⁸ и в астроцитах, когда окисление митохондриальных жирных кислот блокируется¹⁸. Кроме того, снижение или изменения СК и OXPHOS были обнаружены при синдроме Барта¹⁹, сердечной недостаточности²⁰, нескольких метаболических^{расстройствах 21} и неврологических^{расстройствах 22,23,24}, а также при различных опухолях 25,26,27,28. Являются ли эти изменения в сборке и уровнях СК первичной причиной или представляют собой вторичные эффекты в этих патологических ситуациях, все еще исследуется^15,16. Различные методологии могут давать информацию о сборке и функционировании ПК; К ним относятся измерения активности ^8,29, ультраструктурный анализ^30,31 и протеомика^32,33. Полезной альтернативой, которая все чаще используется и является отправной точкой для некоторых из ранее упомянутых методологий, является прямое определение статуса сборки SC с помощью электрофореза Blue native (BN), разработанного для этой цели группой^{Шеггера 34,35}.

Этот подход требует воспроизводимых и эффективных процедур для получения и солюбилизации митохондриальных мембран и может быть дополнен другими методами, такими как анализ активности в геле (IGA), электрофорез второго измерения и вестерн-блот (WB). Ограничением в исследованиях динамики СК с помощью электрофореза BN может быть количество исходных клеток или образцов тканей. Мы представляем серию протоколов для анализа сборки и функции СК, адаптированных на основе групповых методов Шеггера, которые могут быть применены к свежим или замороженным образцам клеток или тканей, начиная с 20 мг ткани.