Isolierung von Mitochondrien für die mitochondriale Superkomplexanalyse aus kleinen Gewebe- und Zellkulturproben
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Analyse von respiratorischen Superkomplexen, wenn nur geringe Mengen an Proben zur Verfügung stehen.
Abstract
In den letzten Jahrzehnten haben die gesammelten Beweise für die Existenz von respiratorischen Superkomplexen (SCs) unser Verständnis der Organisation der mitochondrialen Elektronentransportkette verändert, was zu dem Vorschlag des “Plastizitätsmodells” führte. Dieses Modell postuliert die Koexistenz unterschiedlicher Anteile von SCs und Komplexen in Abhängigkeit vom Gewebe bzw. dem zellulären Stoffwechselstatus. Die dynamische Natur der Anordnung in SCs würde es den Zellen ermöglichen, die Nutzung der verfügbaren Brennstoffe und die Effizienz des Elektronentransfers zu optimieren, die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies zu minimieren und die Fähigkeit der Zellen zur Anpassung an Umweltveränderungen zu begünstigen.
In jüngerer Zeit wurden Anomalien in der SC-Assemblierung bei verschiedenen Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen (Alzheimer und Parkinson), Barth-Syndrom, Leigh-Syndrom oder Krebs berichtet. Die Rolle von Veränderungen der SC-Assemblierung bei der Krankheitsprogression muss noch bestätigt werden. Dennoch ist die Verfügbarkeit ausreichender Mengen an Proben zur Bestimmung des SC-Montagestatus oft eine Herausforderung. Dies geschieht bei Biopsie- oder Gewebeproben, die klein sind oder für mehrere Analysen geteilt werden müssen, bei Zellkulturen, die ein langsames Wachstum aufweisen oder aus mikrofluidischen Geräten stammen, bei einigen Primärkulturen oder seltenen Zellen, oder wenn die Wirkung bestimmter kostspieliger Behandlungen analysiert werden muss (mit Nanopartikeln, sehr teuren Verbindungen usw.). In diesen Fällen ist eine effiziente und einfach anzuwendende Methode erforderlich. In dieser Arbeit wird ein Verfahren vorgestellt, das geeignet ist, angereicherte mitochondriale Fraktionen aus kleinen Mengen von Zellen oder Geweben zu erhalten, um die Struktur und Funktion mitochondrialer SCs durch native Elektrophorese zu analysieren, gefolgt von In-Gel-Aktivitätsassays oder Western Blot.
Introduction
Superkomplexe (SCs) sind supramolekulare Assoziationen zwischen einzelnen Komplexen der Atmungskette 1,2. Seit der erstmaligen Identifizierung von SCs und der Beschreibung ihrer Zusammensetzung durch die Gruppe von Schägger 2,3, die später von anderen Gruppen bestätigt wurde, wurde festgestellt, dass sie die respiratorischen Komplexe I, III und IV (CI, CIII bzw. CIV) in unterschiedlichen Stöchiometrien enthalten. Es können zwei Hauptpopulationen von SC definiert werden: solche, die CI enthalten (und entweder CIII allein oder CIII und CIV) und mit sehr hohem Molekulargewicht (MW, beginnend mit ~1,5 MDa für die kleinere SC: CI + CIII2) und solche, die CIII und CIV, aber nicht CI enthalten, mit viel kleinerer Größe (wie CIII2 + CIV mit ~680 kDa). Diese SCs koexistieren in der inneren Mitochondrienmembran mit freien Komplexen, ebenfalls in unterschiedlichen Anteilen. Während CI also hauptsächlich in seinen assoziierten Formen vorkommt (d. h. in SCs: ~80 % im Rinderherz und mehr als 90 % in vielen menschlichen Zelltypen)3, ist CIV in seiner freien Form sehr häufig (mehr als 80 % im Rinderherzen), wobei CIII eine ausgewogenere Verteilung aufweist (~40 % in seiner häufigeren freien Form, als Dimer, im Rinderherz).
Während ihre Existenz heute allgemein anerkannt ist, wird ihre genaue Rolle immer noch diskutiert 4,5,6,7,8,9,10. Nach dem Plastizitätsmodell können je nach Zelltyp oder Stoffwechselstatus unterschiedliche Anteile an SCs und einzelnen Komplexen existieren 1,7,11. Dieser dynamische Charakter der Anordnung würde es den Zellen ermöglichen, den Verbrauch verfügbarer Brennstoffe und die Effizienz des oxidativen Phosphorylierungssystems (OXPHOS) als Reaktion auf Umweltveränderungen zu regulieren 4,5,7. SCs könnten auch dazu beitragen, die Erzeugungsrate der reaktiven Sauerstoffspezies zu kontrollieren und an der Stabilisierung und dem Umsatz einzelner Komplexeteilzunehmen 4,12,13,14. Modifikationen des SC-Assemblierungsstatus wurden im Zusammenhang mit verschiedenen physiologischen und pathologischen Situationen15,16 und mit dem Alterungsprozess17 beschrieben.
So wurden Veränderungen in den SC-Mustern in Hefe in Abhängigkeit von der für das Wachstum verwendeten Kohlenstoffquellebeschrieben 2 und in kultivierten Säugetierzellen, wenn Glukose durch Galaktose substituiert wird4. Modifikationen wurden auch in der Leber von Mäusen nach dem Fasten berichtet8 und in Astrozyten, wenn die mitochondriale Fettsäureoxidation blockiert ist18. Darüber hinaus wurde eine Abnahme oder Veränderung von SCs und OXPHOS bei Barth-Syndrom19, Herzinsuffizienz20, mehreren metabolischen21 und neurologischen 22,23,24 Erkrankungen und verschiedenen Tumoren 25,26,27,28 festgestellt. Ob diese Veränderungen in der SC-Assemblierung und -Spiegel eine primäre Ursache oder sekundäre Effekte in diesen pathologischen Situationen darstellen, wird noch untersucht15,16. Unterschiedliche Methoden können Aufschluss über den Aufbau und die Funktion von SCs geben; Dazu gehören Aktivitätsmessungen 8,29, Ultrastrukturanalyse30,31 und Proteomik32,33. Eine nützliche Alternative, die zunehmend eingesetzt wird und den Ausgangspunkt für einige der zuvor genannten Methoden bildet, ist die direkte Bestimmung des SC-Assemblierungsstatus mittels Blue Native (BN) Elektrophorese, die zu diesem Zweck von Schäggers Gruppe34,35 entwickelt wurde.
Dieser Ansatz erfordert reproduzierbare und effiziente Verfahren zur Gewinnung und Solubilisierung von Mitochondrienmembranen und kann durch andere Techniken wie In-Gel-Aktivitätsanalyse (IGA), Second-Dimension-Elektrophorese und Western Blot (WB) ergänzt werden. Eine Einschränkung in den Untersuchungen zur SC-Dynamik mittels BN-Elektrophorese kann die Menge der Ausgangszellen oder Gewebeproben sein. Wir stellen eine Reihe von Protokollen für die Analyse der SC-Assemblierung und -Funktion vor, die von den Methoden der Schägger-Gruppe adaptiert wurden und auf frische oder gefrorene Zell- oder Gewebeproben ab nur 20 mg Gewebe angewendet werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die methodischen Anpassungen, die in den hier beschriebenen Protokollen eingeführt wurden, zielen darauf ab, Verluste zu vermeiden und die Ausbeute zu erhöhen, während die Aktivitäten des mitochondrialen Komplexes erhalten bleiben (was entscheidend ist, wenn die Verfügbarkeit ausreichender Probenmengen beeinträchtigt ist) und das erwartete Muster von SCs des Gewebes oder der Zelllinie reproduziert wird (siehe Abbildung 2C). Zu diesem Zweck und da eine hohe mitochondriale Reinheit nicht…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Fördernummer “PGC2018-095795-B-I00” des Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) und durch die Fördernummer “Grupo de Referencia: E35_17R” und die Fördernummer “LMP220_21” der Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) an PF-S und RM-L unterstützt.
Materials
| Acetic acid | PanReac | 131008 | |
| Aminocaproic acid | Fluka Analytical | 7260 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Bis Tris | Acrons Organics | 327721000 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Coomassie Blue G-250 | Serva | 17524 | |
| Coomassie Blue R-250 | Merck | 1125530025 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| Diamino benzidine (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| EDTA | PanReac | 131669 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fatty acids free BSA | Roche | 10775835001 | |
| Glycine | PanReac | A1067 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| K2HPO4 | PanReac | 121512 | |
| KH2PO4 | PanReac | 121509 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Methanol | Labkem | MTOL-P0P | |
| MgSO4 | PanReac | 131404 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MTCO1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459600 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels | Invitrogen | BN1001BOX | |
| NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x) | Invitrogen | BN2002 | |
| NativePAGE Running Buffer (20x) | Invitrogen | BN2001 | |
| NDUFA9 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459100 | |
| Nitroblue tetrazolium salt (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Pb(NO3)2 | Sigma-Aldrich | 228621 | |
| PDVF Membrane | Amersham | 10600023 | |
| Phenazine methasulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Pierce ECL Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| SDHA Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459200 | |
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| Tris | PanReac | A2264 | |
| UQCRC1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459140 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
Referenzen
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).
- Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
- Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes. EMBO Rep. 24 (11), e57092 (2023).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Milenkovic, D., et al. Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes. Cell Metab. 35 (10), 1799-1813 (2023).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
- Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P., Ostojic, S. . Clinical Bioenergetics. , 3-60 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain. Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).
- Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role. Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).
- Lopez-Fabuel, I., et al. Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).
- Mukherjee, S., Ghosh, A. Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases. Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).
- Nesci, S., et al. Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology. Life (Basel). 11 (3), 242 (2021).
- Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).
- Morant-Ferrando, B., et al. Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition. Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients. J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).
- Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
- Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935 (2020).
- Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
- Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600 (2020).
- Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging. Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).
- Hollinshead, K. E. R., et al. Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer. Cell Rep. 33 (1), 108231 (2020).
- Ikeda, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance. Nat Commun. 10 (1), 4108 (2019).
- Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer. Front Cell Dev Biol. 10, 717881 (2022).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers (Basel). 11 (7), 1027 (2019).
- Moreno-Loshuertos, R., et al. How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria. Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).
- Vonck, J., Schafer, E. Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).
- Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Gonzalez-Franquesa, A., et al. Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity. Cell Rep. 35 (8), 109180 (2021).
- Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. J Vis Exp. (49), e2452 (2011).
- Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182 (2019).
- Schagger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Chomyn, A., et al. Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals–and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers. Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).
- Moreno-Loshuertos, R., et al. Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants. Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).
- Fernández-Vizarra, E., Fernández-Silva, P., Enríquez, J. A., Celis, J. E. . Cell Biology (Third Edition). , 69-77 (2006).
- Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332 (2021).
