Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares
Summary
Este protocolo describe una técnica para el análisis de supercomplejos respiratorios cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de muestras.
Abstract
A lo largo de las últimas décadas, la evidencia acumulada sobre la existencia de supercomplejos respiratorios (SCs) ha cambiado nuestra comprensión de la organización de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, dando lugar a la propuesta del “modelo de plasticidad”. Este modelo postula la coexistencia de diferentes proporciones de SCs y complejos en función del tejido o del estado metabólico celular. La naturaleza dinámica del ensamblaje en las SC permitiría a las células optimizar el uso de los combustibles disponibles y la eficiencia de la transferencia de electrones, minimizando la generación de especies reactivas de oxígeno y favoreciendo la capacidad de las células para adaptarse a los cambios ambientales.
Más recientemente, se han descrito anomalías en el ensamblaje de SC en diferentes enfermedades como trastornos neurodegenerativos (enfermedad de Alzheimer y Parkinson), síndrome de Barth, síndrome de Leigh o cáncer. El papel de las alteraciones del ensamblaje de las SC en la progresión de la enfermedad aún debe confirmarse. Sin embargo, la disponibilidad de cantidades suficientes de muestras para determinar el estado del ensamblaje SC es a menudo un desafío. Esto sucede con biopsias o muestras de tejido que son pequeñas o que deben dividirse para múltiples análisis, con cultivos celulares que tienen un crecimiento lento o provienen de dispositivos microfluídicos, con algunos cultivos primarios o células raras, o cuando se debe analizar el efecto de tratamientos costosos particulares (con nanopartículas, compuestos muy caros, etc.). En estos casos, se requiere un método eficiente y fácil de aplicar. En este trabajo se presenta un método adaptado para obtener fracciones mitocondriales enriquecidas a partir de pequeñas cantidades de células o tejidos para analizar la estructura y función de las SC mitocondriales mediante electroforesis nativa seguida de ensayos de actividad in-gel o western blot.
Introduction
Los supercomplejos (SC) son asociaciones supramoleculares entre complejos de cadenas respiratorias individuales 1,2. A partir de la identificación inicial de las SC y la descripción de su composición por el grupo de Schägger 2,3, posteriormente confirmada por otros grupos, se estableció que contienen complejos respiratorios I, III y IV (CI, CIII y CIV, respectivamente) en diferentes estequiometrías. Se pueden definir dos poblaciones principales de SC, las que contienen CI (y CIII solo o CIII y CIV) y con un peso molecular muy alto (MW, comenzando ~1,5 MDa para las SC más pequeñas: CI + CIII2) y las que contienen CIII y CIV pero no CI, con un tamaño mucho menor (como CIII2 + CIV con ~680 kDa). Estas SC coexisten en la membrana mitocondrial interna con complejos libres, también en diferentes proporciones. Así, mientras que el CI se encuentra principalmente en sus formas asociadas (es decir, en las SC: ~80% en el corazón bovino y más del 90% en muchos tipos de células humanas)3, el CIV es muy abundante en su forma libre (más del 80% en el corazón bovino), con CIII mostrando una distribución más equilibrada (~40% en su forma libre más abundante, como un dímero, en corazón bovino).
Si bien su existencia es ahora generalmente aceptada, su papel preciso sigue siendo objeto de debate 4,5,6,7,8,9,10. De acuerdo con el modelo de plasticidad, pueden existir diferentes proporciones de SCs y complejos individuales dependiendo del tipo de célula o del estado metabólico 1,7,11. Esta naturaleza dinámica del ensamblaje permitiría a las células regular el uso de los combustibles disponibles y la eficiencia del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) en respuesta a los cambios ambientales 4,5,7. Las SC también podrían contribuir al control de la tasa de generación de especies reactivas de oxígeno y participar en la estabilización y renovación de complejos individuales 4,12,13,14. Se han descrito modificaciones del estado de ensamblaje del SC en asociación a diferentes situaciones fisiológicas y patológicas15,16 y al proceso de envejecimiento17.
Así, se han descrito cambios en los patrones de SC en levaduras dependiendo de la fuente de carbono utilizada para el crecimiento2 y en células de mamíferos cultivadas cuando la glucosa es sustituida por galactosa4. También se han reportado modificaciones en el hígado de ratón después del ayuno8 y en los astrocitos cuando se bloquea la oxidación de los ácidos grasos mitocondriales18. Además, se ha encontrado una disminución o alteraciones de las SC y OXPHOS en el síndrome de Barth19, la insuficiencia cardíaca20, varios trastornos metabólicos21 y neurológicos 22,23,24 y diferentes tumores 25,26,27,28 . Todavía se investiga si estas alteraciones en el ensamblaje y los niveles de SC son una causa primaria o representan efectos secundarios en estas situaciones patológicas15,16. Diferentes metodologías pueden dar información sobre el ensamblaje y la función de los SC; Estos incluyen mediciones de actividad 8,29, análisis ultraestructural30,31 y proteómica32,33. Una alternativa útil que se está empleando cada vez más y que es el punto de partida de algunas de las metodologías mencionadas anteriormente es la determinación directa del estado de ensamblaje de SC mediante electroforesis nativa azul (BN) desarrollada para este fin por el grupo de Schägger34,35.
Este enfoque requiere procedimientos reproducibles y eficientes para obtener y solubilizar las membranas mitocondriales y puede complementarse con otras técnicas como el análisis de actividad en gel (IGA), la electroforesis de segunda dimensión y el western blot (WB). Una limitación en los estudios sobre la dinámica de las SC mediante electroforesis BN puede ser la cantidad de células de partida o muestras de tejido. Presentamos una serie de protocolos para el análisis del ensamblaje y la función de las SC, adaptados de los métodos del grupo de Schägger, que se pueden aplicar a muestras de células o tejidos frescos o congelados a partir de tan solo 20 mg de tejido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las adaptaciones metodológicas introducidas en los protocolos aquí descritos están destinadas a evitar pérdidas y aumentar el rendimiento, manteniendo al mismo tiempo las actividades del complejo mitocondrial (lo cual es crucial cuando la disponibilidad de cantidades suficientes de muestras se ve comprometida) y reproducir el patrón esperado de SC del tejido o de la línea celular (ver Figura 2C). Con este propósito y dado que no se requiere una alta pureza mitocondrial para detectar c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha contado con el apoyo de la subvención número “PGC2018-095795-B-I00” del Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) y de las subvenciones “Grupo de Referencia: E35_17R” y subvención número “LMP220_21” de la Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) a PF-S y RM-L.
Materials
| Acetic acid | PanReac | 131008 | |
| Aminocaproic acid | Fluka Analytical | 7260 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Bis Tris | Acrons Organics | 327721000 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Coomassie Blue G-250 | Serva | 17524 | |
| Coomassie Blue R-250 | Merck | 1125530025 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| Diamino benzidine (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| EDTA | PanReac | 131669 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fatty acids free BSA | Roche | 10775835001 | |
| Glycine | PanReac | A1067 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| K2HPO4 | PanReac | 121512 | |
| KH2PO4 | PanReac | 121509 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Methanol | Labkem | MTOL-P0P | |
| MgSO4 | PanReac | 131404 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MTCO1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459600 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels | Invitrogen | BN1001BOX | |
| NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x) | Invitrogen | BN2002 | |
| NativePAGE Running Buffer (20x) | Invitrogen | BN2001 | |
| NDUFA9 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459100 | |
| Nitroblue tetrazolium salt (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Pb(NO3)2 | Sigma-Aldrich | 228621 | |
| PDVF Membrane | Amersham | 10600023 | |
| Phenazine methasulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Pierce ECL Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| SDHA Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459200 | |
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| Tris | PanReac | A2264 | |
| UQCRC1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459140 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
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