Isolamento de mitocôndrias para análise de supercomplexos mitocondriais a partir de pequenas amostras de cultura de tecidos e células

Supercomplexos (SCs) são associações supramoleculares entre complexos individuais da cadeia respiratória ^1,2. Desde a identificação inicial das CTs e a descrição de sua composição pelo grupo de Schägger ^2,3, posteriormente confirmada por outros grupos, estabeleceu-se que elas contêm complexos respiratórios I, III e IV (IC, CIII e CIV, respectivamente) em diferentes estequiometrias. Duas populações principais de SCs podem ser definidas, aquelas contendo CI (e CIII sozinho ou CIII e CIV) e com peso molecular muito alto (MW, começando ~ 1,5 MDa para o SC menor: CI + CIII₂) e aquelas contendo CIII e CIV, mas não CI, com tamanho muito menor (como CIII₂ + CIV com ~ 680 kDa). Esses SCs coexistem na membrana mitocondrial interna com complexos livres, também em diferentes proporções. Assim, enquanto o CI é encontrado principalmente em suas formas associadas (ou seja, em SCs: ~ 80% no coração bovino e mais de 90% em muitos tipos de células humanas)³, o CIV é muito abundante em sua forma livre (mais de 80% no coração bovino), com o CIII mostrando uma distribuição mais equilibrada (~ 40% em sua forma livre mais abundante, como um dímero, em coração bovino).

Embora sua existência seja agora geralmente aceita, seu papel preciso ainda está em debate 4,5,6,7,8,9,10. De acordo com o modelo de plasticidade, podem existir diferentes proporções de CTs e complexos individuais, dependendo do tipo de célula ou do estado metabólico ^1,7,11. Essa natureza dinâmica da montagem permitiria que as células regulassem o uso dos combustíveis disponíveis e a eficiência do sistema de fosforilação oxidativa (OXPHOS) em resposta às mudanças ambientais ^4,5,7. As CCs também podem contribuir para controlar a taxa de geração de espécies reativas de oxigênio e participar da estabilização e renovação de complexos individuais 4,12,13,14. Modificações do estado de montagem do CS têm sido descritas em associação com diferentes situações fisiológicas e patológicas^15,16 e com o processo de envelhecimento¹⁷.

Assim, mudanças nos padrões de SC têm sido descritas em leveduras dependendo da fonte de carbono utilizada para o crescimento² e em células de mamíferos cultivadas quando a glicose é substituída por galactose⁴. Modificações também foram relatadas no fígado de camundongos após jejum⁸ e em astrócitos quando a oxidação de ácidos graxos mitocondriais é bloqueada¹⁸. Além disso, uma diminuição ou alterações nas CSs e OXPHOS foram encontradas na síndrome de Barth¹⁹, insuficiência cardíaca²⁰, vários distúrbios metabólicos²¹ e neurológicos 22,23,24 e diferentes tumores 25,26,27,28. Se essas alterações na montagem e nos níveis de CS são uma causa primária ou representam efeitos secundários nessas situações patológicas ainda está sob investigação^15,16. Diferentes metodologias podem fornecer informações sobre a montagem e função dos SCs; Estes incluem medições de atividade ^8,29, análise ultraestrutural^30,31 e proteômica^32,33. Uma alternativa útil que está sendo cada vez mais empregada e é o ponto de partida para algumas das metodologias mencionadas anteriormente é a determinação direta do status de montagem do SC por eletroforese nativa azul (BN) desenvolvida para esse fim pelo grupo de Schägger^34,35.

Essa abordagem requer procedimentos reprodutíveis e eficientes para obter e solubilizar membranas mitocondriais e pode ser complementada por outras técnicas, como análise de atividade em gel (IGA), eletroforese de segunda dimensão e western blot (WB). Uma limitação nos estudos sobre a dinâmica do SC por eletroforese de BN pode ser a quantidade de células iniciais ou amostras de tecido. Apresentamos uma série de protocolos para a análise da montagem e função do SC, adaptados dos métodos de grupo de Schägger, que podem ser aplicados a amostras de células ou tecidos frescos ou congelados a partir de apenas 20 mg de tecido.