عزل الميتوكوندريا لتحليل الميتوكوندريا فائقة التعقيد من عينات زراعة الأنسجة والخلايا الصغيرة
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية لتحليل المعقدات التنفسية الفائقة عندما تتوفر كميات صغيرة فقط من العينات.
Abstract
على مدى العقود الماضية ، غيرت الأدلة المتراكمة حول وجود مجمعات الجهاز التنفسي (SCs) فهمنا لتنظيم سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا ، مما أدى إلى اقتراح “نموذج اللدونة”. يفترض هذا النموذج التعايش بين نسب مختلفة من SCs والمجمعات اعتمادا على الأنسجة أو حالة التمثيل الغذائي الخلوي. ستسمح الطبيعة الديناميكية للتجميع في SCs للخلايا بتحسين استخدام الوقود المتاح وكفاءة نقل الإلكترون ، وتقليل توليد أنواع الأكسجين التفاعلية وتفضيل قدرة الخلايا على التكيف مع التغيرات البيئية.
في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن تشوهات في تجميع SC في أمراض مختلفة مثل الاضطرابات التنكسية العصبية (مرض الزهايمر ومرض باركنسون) أو متلازمة بارث أو متلازمة لي أو السرطان. لا يزال دور تعديلات تجميع SC في تطور المرض بحاجة إلى تأكيد. ومع ذلك، فإن توافر كميات كافية من العينات لتحديد حالة تجميع اللجنة العليا غالبا ما يشكل تحديا. يحدث هذا مع الخزعة أو عينات الأنسجة الصغيرة أو التي يجب تقسيمها لإجراء تحليلات متعددة ، مع مزارع الخلايا ذات النمو البطيء أو تأتي من أجهزة الموائع الدقيقة ، مع بعض الثقافات الأولية أو الخلايا النادرة ، أو عندما يجب تحليل تأثير علاجات مكلفة معينة (مع الجسيمات النانوية ، والمركبات باهظة الثمن ، وما إلى ذلك). في هذه الحالات ، يلزم وجود طريقة فعالة وسهلة التطبيق. تقدم هذه الورقة طريقة تم تكييفها للحصول على كسور الميتوكوندريا المخصبة من كميات صغيرة من الخلايا أو الأنسجة لتحليل بنية ووظيفة SCs الميتوكوندريا عن طريق الرحلان الكهربائي الأصلي متبوعا بمقايسات نشاط الهلام أو اللطخة الغربية.
Introduction
المجمعات الفائقة (SCs) هي ارتباطات فوق جزيئية بين مجمعات السلسلة التنفسية الفردية 1,2. منذ التحديد الأولي للطوائف المنبوذة ووصف تكوينها من قبل مجموعة Schägger 2,3 ، والتي أكدتها لاحقا مجموعات أخرى ، ثبت أنها تحتوي على مجمعات تنفسية I و III و IV (CI ، CIII ، و CIV ، على التوالي) في مقاييس متكافئة مختلفة. يمكن تعريف مجموعتين رئيسيتين من SCs ، تلك التي تحتوي على CII (وإما CIII وحدها أو CIII و CIV) وذات وزن جزيئي مرتفع جدا (MW ، بدءا من ~ 1.5 MDa ل SC الأصغر: CI + CIII2) وتلك التي تحتوي على CIII و CIV ولكن ليس CI ، مع حجم أصغر بكثير (مثل CIII2 + CIV مع ~ 680 كيلو دالتون). تتعايش هذه SCs في غشاء الميتوكوندريا الداخلي مع مجمعات حرة ، أيضا بنسب مختلفة. وهكذا ، في حين أن CI موجود في الغالب في الأشكال المرتبطة به (أي في SCs: ~ 80٪ في قلب الأبقار وأكثر من 90٪ في العديد من أنواع الخلايا البشرية)3 ، فإن CIV وفيرة جدا في شكلها الحر (أكثر من 80٪ في قلب الأبقار) ، مع CIII يظهر توزيعا أكثر توازنا (~ 40٪ في شكله الحر الأكثر وفرة ، كدايمر ، في قلب الأبقار).
في حين أن وجودها مقبول الآن بشكل عام ، إلا أن دورها الدقيق لا يزال قيد النقاش4،5،6،7،8،9،10. وفقا لنموذج اللدونة ، يمكن أن توجد نسب مختلفة من SCs والمجمعات الفردية اعتمادا على نوع الخلية أو الحالة الأيضية1،7،11. هذه الطبيعة الديناميكية للتجميع ستسمح للخلايا بتنظيم استخدام الوقود المتاح وكفاءة نظام الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) استجابة للتغيرات البيئية4،5،7. يمكن أن تساهم SCs أيضا في التحكم في معدل توليد أنواع الأكسجين التفاعلية والمشاركة في تثبيت ودوران المجمعات الفردية4،12،13،14. تم وصف تعديلات حالة تجميع SC بالاقتران مع الحالات الفسيولوجية والمرضية المختلفة15,16 ومع عملية الشيخوخة17.
وهكذا ، تم وصف التغيرات في أنماط SC في الخميرة اعتمادا على مصدر الكربون المستخدم للنمو2 وفي خلايا الثدييات المستزرعة عندما يتم استبدال الجلوكوز بالجالاكتوز4. كما تم الإبلاغ عن تعديلات في كبد الفأر بعد الصيام8 وفي الخلايا النجمية عندما يتم حظر أكسدة الأحماض الدهنية الميتوكوندريا18. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على انخفاض أو تغيرات في SCs و OXPHOS في متلازمة بارث19 ، وفشل القلب20 ، والعديد من الاضطرابات الأيضية21 والعصبية22،23،24 ، وأورام مختلفة25،26،27،28. ما إذا كانت هذه التغييرات في تجميع SC ومستوياته هي السبب الرئيسي أو تمثل آثارا ثانوية في هذه الحالات المرضية لا تزال قيد التحقيق15,16. ويمكن أن توفر المنهجيات المختلفة معلومات عن تجميع الطوائف المنبوذة ووظيفتها؛ وتشمل هذه قياسات النشاط8،29 ، وتحليل البنية التحتية30،31 ، والبروتينات32،33. البديل المفيد الذي يتم استخدامه بشكل متزايد وهو نقطة البداية لبعض المنهجيات المذكورة سابقا هو التحديد المباشر لحالة تجميع SC بواسطة الرحلان الكهربائي الأزرق الأصلي (BN) الذي طورته مجموعة Schägger34,35 لهذا الغرض.
يتطلب هذا النهج إجراءات قابلة للتكرار وفعالة للحصول على أغشية الميتوكوندريا وإذابتها ويمكن استكمالها بتقنيات أخرى مثل تحليل النشاط داخل الهلام (IGA) ، والرحلان الكهربائي للبعد الثاني ، واللطخة الغربية (WB). يمكن أن يكون أحد القيود في الدراسات حول ديناميكيات SC بواسطة الرحلان الكهربائي BN هو كمية خلايا البدء أو عينات الأنسجة. نقدم سلسلة من البروتوكولات لتحليل تجميع SC ووظيفته ، مقتبسة من طرق مجموعة Schägger ، والتي يمكن تطبيقها على عينات الخلايا أو الأنسجة الطازجة أو المجمدة بدءا من 20 مجم من الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تهدف التعديلات المنهجية التي تم إدخالها في البروتوكولات الموصوفة هنا إلى تجنب الخسائر وزيادة الغلة مع الحفاظ على الأنشطة المعقدة للميتوكوندريا (وهو أمر بالغ الأهمية عندما يتعرض توافر كميات كافية من العينات للخطر) وإعادة إنتاج النمط المتوقع للأنسجة أو خط الخلية من SCs (انظر الش?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال المنحة رقم “PGC2018-095795-B-I00” من وزارة العلوم والابتكار (https://ciencia.sede.gob.es/) والمنح “Grupo de Referencia: E35_17R” والمنحة رقم “LMP220_21” من Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) إلى PF-S و RM-L.
Materials
| Acetic acid | PanReac | 131008 | |
| Aminocaproic acid | Fluka Analytical | 7260 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Bis Tris | Acrons Organics | 327721000 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Coomassie Blue G-250 | Serva | 17524 | |
| Coomassie Blue R-250 | Merck | 1125530025 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| Diamino benzidine (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| EDTA | PanReac | 131669 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fatty acids free BSA | Roche | 10775835001 | |
| Glycine | PanReac | A1067 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| K2HPO4 | PanReac | 121512 | |
| KH2PO4 | PanReac | 121509 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Methanol | Labkem | MTOL-P0P | |
| MgSO4 | PanReac | 131404 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MTCO1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459600 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels | Invitrogen | BN1001BOX | |
| NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x) | Invitrogen | BN2002 | |
| NativePAGE Running Buffer (20x) | Invitrogen | BN2001 | |
| NDUFA9 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459100 | |
| Nitroblue tetrazolium salt (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Pb(NO3)2 | Sigma-Aldrich | 228621 | |
| PDVF Membrane | Amersham | 10600023 | |
| Phenazine methasulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Pierce ECL Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| SDHA Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459200 | |
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| Tris | PanReac | A2264 | |
| UQCRC1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459140 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
References
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).
- Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
- Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes. EMBO Rep. 24 (11), e57092 (2023).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Milenkovic, D., et al. Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes. Cell Metab. 35 (10), 1799-1813 (2023).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
- Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P., Ostojic, S. . Clinical Bioenergetics. , 3-60 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain. Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).
- Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role. Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).
- Lopez-Fabuel, I., et al. Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).
- Mukherjee, S., Ghosh, A. Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases. Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).
- Nesci, S., et al. Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology. Life (Basel). 11 (3), 242 (2021).
- Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).
- Morant-Ferrando, B., et al. Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition. Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients. J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).
- Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
- Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935 (2020).
- Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
- Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600 (2020).
- Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging. Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).
- Hollinshead, K. E. R., et al. Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer. Cell Rep. 33 (1), 108231 (2020).
- Ikeda, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance. Nat Commun. 10 (1), 4108 (2019).
- Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer. Front Cell Dev Biol. 10, 717881 (2022).
- Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers (Basel). 11 (7), 1027 (2019).
- Moreno-Loshuertos, R., et al. How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria. Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).
- Vonck, J., Schafer, E. Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).
- Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Gonzalez-Franquesa, A., et al. Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity. Cell Rep. 35 (8), 109180 (2021).
- Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. J Vis Exp. (49), e2452 (2011).
- Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182 (2019).
- Schagger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Chomyn, A., et al. Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals–and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers. Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).
- Moreno-Loshuertos, R., et al. Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants. Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).
- Fernández-Vizarra, E., Fernández-Silva, P., Enríquez, J. A., Celis, J. E. . Cell Biology (Third Edition). , 69-77 (2006).
- Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332 (2021).
