Isolamento dei mitocondri per l'analisi dei supercomplessi mitocondriali da piccoli campioni di tessuti e colture cellulari
Summary
Questo protocollo descrive una tecnica per l’analisi dei supercomplessi respiratori quando sono disponibili solo piccole quantità di campioni.
Abstract
Negli ultimi decenni, le prove accumulate sull’esistenza di supercomplessi respiratori (SC) hanno cambiato la nostra comprensione dell’organizzazione della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali, dando origine alla proposta del “modello di plasticità”. Questo modello postula la coesistenza di diverse proporzioni di SC e complessi a seconda del tessuto o dello stato metabolico cellulare. La natura dinamica dell’assemblaggio nelle SC consentirebbe alle celle di ottimizzare l’uso dei combustibili disponibili e l’efficienza del trasferimento di elettroni, minimizzando la generazione di specie reattive dell’ossigeno e favorendo la capacità delle celle di adattarsi ai cambiamenti ambientali.
Più recentemente, sono state riportate anomalie nell’assemblaggio SC in diverse malattie come le malattie neurodegenerative (morbo di Alzheimer e Parkinson), la sindrome di Barth, la sindrome di Leigh o il cancro. Il ruolo delle alterazioni dell’assemblaggio SC nella progressione della malattia deve ancora essere confermato. Tuttavia, la disponibilità di quantità sufficienti di campioni per determinare lo stato dell’assemblaggio SC è spesso una sfida. Questo accade con biopsie o campioni di tessuto che sono piccoli o devono essere divisi per analisi multiple, con colture cellulari che hanno una crescita lenta o provengono da dispositivi microfluidici, con alcune colture primarie o cellule rare, o quando si deve analizzare l’effetto di trattamenti particolarmente costosi (con nanoparticelle, composti molto costosi, ecc.). In questi casi, è necessario un metodo efficiente e facile da applicare. Questo articolo presenta un metodo adattato per ottenere frazioni mitocondriali arricchite da piccole quantità di cellule o tessuti per analizzare la struttura e la funzione delle SC mitocondriali mediante elettroforesi nativa seguita da saggi di attività in-gel o western blot.
Introduction
I supercomplessi (SC) sono associazioni supramolecolari tra singoli complessi della catena respiratoria 1,2. Dall’identificazione iniziale delle SC e dalla descrizione della loro composizione da parte del gruppo di Schägger 2,3, successivamente confermata da altri gruppi, è stato stabilito che esse contengono i complessi respiratori I, III e IV (CI, CIII e CIV, rispettivamente) in diverse stechiometrie. Si possono definire due principali popolazioni di SC, quelle contenenti CI (e CIII da solo o CIII e CIV) e con peso molecolare molto elevato (MW, a partire da ~1,5 MDa per le SC più piccole: CI + CIII2) e quelle contenenti CIII e CIV ma non CI, con dimensioni molto più piccole (come CIII2 + CIV con ~680 kDa). Queste SC coesistono nella membrana mitocondriale interna con complessi liberi, anche in proporzioni diverse. Così, mentre l’IC si trova principalmente nelle sue forme associate (cioè nelle SC: ~80% nel cuore bovino e più del 90% in molti tipi di cellule umane)3, l’ICV è molto abbondante nella sua forma libera (più dell’80% nel cuore bovino), con CIII che mostra una distribuzione più equilibrata (~40% nella sua forma libera più abbondante, come un dimero, nel cuore bovino).
Mentre la loro esistenza è ora generalmente accettata, il loro ruolo preciso è ancora oggetto di dibattito 4,5,6,7,8,9,10. Secondo il modello di plasticità, possono esistere diverse proporzioni di SC e singoli complessi a seconda del tipo di cellula o dello stato metabolico 1,7,11. Questa natura dinamica dell’assemblaggio consentirebbe alle celle di regolare l’uso dei combustibili disponibili e l’efficienza del sistema di fosforilazione ossidativa (OXPHOS) in risposta ai cambiamenti ambientali 4,5,7. Le SC potrebbero anche contribuire a controllare il tasso di generazione delle specie reattive dell’ossigeno e partecipare alla stabilizzazione e al turnover dei singoli complessi 4,12,13,14. Sono state descritte modificazioni dello stato di assemblaggio delle SC in associazione con diverse situazioni fisiologiche e patologiche15,16 e con il processo di invecchiamento17.
Pertanto, sono stati descritti cambiamenti nei pattern SC nel lievito a seconda della fonte di carbonio utilizzata per la crescita2 e nelle cellule di mammifero in coltura quando il glucosio è sostituito dal galattosio4. Sono state riportate anche modifiche nel fegato di topo dopo il digiuno8 e negli astrociti quando l’ossidazione degli acidi grassi mitocondriali è bloccata18. Inoltre, una diminuzione o alterazioni delle SC e dell’OXPHOS sono state riscontrate nella sindrome di Barth19, nell’insufficienza cardiaca20, in diversi disturbi metabolici21 e neurologici 22,23,24 e in diversi tumori 25,26,27,28. Se queste alterazioni nell’assemblaggio e nei livelli di SC siano una causa primaria o rappresentino effetti secondari in queste situazioni patologiche è ancora oggetto di studio15,16. Diverse metodologie possono fornire informazioni sull’assemblaggio e la funzione delle SC; Questi includono le misurazioni dell’attività 8,29, l’analisi ultrastrutturale30,31 e la proteomica32,33. Un’alternativa utile che viene sempre più impiegata ed è il punto di partenza per alcune delle metodologie precedentemente menzionate è la determinazione diretta dello stato di assemblaggio SC mediante elettroforesi Blue native (BN) sviluppata a questo scopo dal gruppo di Schägger34,35.
Questo approccio richiede procedure riproducibili ed efficienti per ottenere e solubilizzare le membrane mitocondriali e può essere integrato da altre tecniche come l’analisi dell’attività in-gel (IGA), l’elettroforesi di seconda dimensione e il western blot (WB). Un limite negli studi sulla dinamica delle SC mediante elettroforesi BN può essere la quantità di cellule di partenza o campioni di tessuto. Presentiamo una serie di protocolli per l’analisi dell’assemblaggio e della funzione delle SC, adattati dai metodi di gruppo di Schägger, che possono essere applicati a campioni di cellule o tessuti freschi o congelati a partire da un minimo di 20 mg di tessuto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli adattamenti metodologici introdotti nei protocolli qui descritti hanno lo scopo di evitare perdite e aumentare la resa mantenendo le attività del complesso mitocondriale (che è cruciale quando la disponibilità di quantità sufficienti di campioni è compromessa) e riprodurre il modello atteso di SC del tessuto o della linea cellulare (vedi Figura 2C). A questo scopo e poiché non è richiesta un’elevata purezza mitocondriale per rilevare correttamente le SC, il numero di passaggi, tem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione numero “PGC2018-095795-B-I00” dal Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) e dalle sovvenzioni “Grupo de Referencia: E35_17R” e dalla sovvenzione numero “LMP220_21” dalla Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) a PF-S e RM-L.
Materials
| Acetic acid | PanReac | 131008 | |
| Aminocaproic acid | Fluka Analytical | 7260 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Bis Tris | Acrons Organics | 327721000 | |
| Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
| Coomassie Blue G-250 | Serva | 17524 | |
| Coomassie Blue R-250 | Merck | 1125530025 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | |
| Diamino benzidine (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| EDTA | PanReac | 131669 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Fatty acids free BSA | Roche | 10775835001 | |
| Glycine | PanReac | A1067 | |
| Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| K2HPO4 | PanReac | 121512 | |
| KH2PO4 | PanReac | 121509 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Methanol | Labkem | MTOL-P0P | |
| MgSO4 | PanReac | 131404 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MTCO1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459600 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels | Invitrogen | BN1001BOX | |
| NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x) | Invitrogen | BN2002 | |
| NativePAGE Running Buffer (20x) | Invitrogen | BN2001 | |
| NDUFA9 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459100 | |
| Nitroblue tetrazolium salt (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Pb(NO3)2 | Sigma-Aldrich | 228621 | |
| PDVF Membrane | Amersham | 10600023 | |
| Phenazine methasulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Pierce ECL Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| SDHA Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459200 | |
| Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
| Tris | PanReac | A2264 | |
| UQCRC1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459140 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
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