Summary

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים

Published: May 03, 2024
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

Abstract

במהלך העשורים האחרונים, הראיות שהצטברו על קיומם של סופרקומפלקסים נשימתיים (SCs) שינו את הבנתנו את ארגון שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה, והולידו את הצעת “מודל הפלסטיות”. מודל זה מניח את הדו-קיום של פרופורציות שונות של SCs וקומפלקסים בהתאם לרקמה או למצב חילוף החומרים הסלולרי. האופי הדינמי של ההרכבה ב-SCs יאפשר לתאים לייעל את השימוש בדלקים זמינים ואת יעילות העברת האלקטרונים, למזער את ייצור מיני החמצן הריאקטיביים ולהעדיף את יכולתם של התאים להסתגל לשינויים סביבתיים.

לאחרונה דווח על חריגות בהרכבת SC במחלות שונות כגון הפרעות נוירודגנרטיביות (אלצהיימר ופרקינסון), תסמונת בארת’, תסמונת לי או סרטן. התפקיד של שינויים הרכבה SC בהתקדמות המחלה עדיין צריך להיות מאושר. עם זאת, הזמינות של כמויות מספיקות של דגימות כדי לקבוע את מצב הרכבה SC הוא לעתים קרובות אתגר. זה קורה עם ביופסיה או דגימות רקמה קטנות או שיש לחלק אותן לניתוחים מרובים, עם תרביות תאים שיש להם צמיחה איטית או מגיעים מהתקנים מיקרופלואידים, עם כמה תרביות ראשוניות או תאים נדירים, או כאשר יש לנתח את ההשפעה של טיפולים יקרים מסוימים (עם ננו-חלקיקים, תרכובות יקרות מאוד וכו ‘). במקרים אלה נדרשת שיטה יעילה וקלה ליישום. מאמר זה מציג שיטה המותאמת להשגת שברים מיטוכונדריאליים מועשרים מכמויות קטנות של תאים או רקמות כדי לנתח את המבנה והתפקוד של SCs מיטוכונדריאליים על ידי אלקטרופורזה טבעית ואחריה בדיקות פעילות בג’ל או כתם מערבי.

Introduction

סופרקומפלקסים (SCs) הם קשרים על-מולקולריים בין קומפלקסים בודדים של שרשרת הנשימה 1,2. מאז הזיהוי הראשוני של SCs ותיאור הרכבם על ידי קבוצת Schägger 2,3, שאושר מאוחר יותר על ידי קבוצות אחרות, נקבע כי הם מכילים מתחמי נשימה I, III ו- IV (CI, CIII ו- CIV, בהתאמה) בסטואיכיומטריות שונות. ניתן להגדיר שתי אוכלוסיות עיקריות של SCs, אלה המכילות CI (ו- CIII בלבד או CIII ו- CIV) ובעלות משקל מולקולרי גבוה מאוד (MW, החל ~ 1.5 MDa עבור SC הקטן יותר: CI + CIII2) ואלה המכילות CIII ו- CIV אך לא CIV, עם גודל קטן בהרבה (כגון CIII2 + CIV עם ~ 680 kDa). SCs אלה מתקיימים יחד בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי עם קומפלקסים חופשיים, גם בפרופורציות שונות. לכן, בעוד CI נמצא בעיקר בצורותיו הקשורות (כלומר, ב- SCs: ~ 80% בלב בקר ויותר מ -90% בסוגי תאים אנושיים רבים)3, CIV שופע מאוד בצורתו החופשית (יותר מ -80% בלב בקר), כאשר CIII מראה התפלגות מאוזנת יותר (~ 40% בצורתו החופשית השופעת יותר, כעמום, בלב בקר).

בעוד קיומם מקובל כיום, תפקידם המדויק עדיין נתון לוויכוח 4,5,6,7,8,9,10. על פי מודל הפלסטיות, פרופורציות שונות של SCs וקומפלקסים בודדים יכולים להתקיים בהתאם לסוג התא או למצב המטבולי 1,7,11. אופי דינמי זה של ההרכבה יאפשר לתאים לווסת את השימוש בדלקים זמינים ואת היעילות של מערכת הזרחן החמצוני (OXPHOS) בתגובה לשינויים סביבתיים 4,5,7. SCs יכולים גם לתרום לשליטה בקצב ייצור מיני חמצן תגובתי ולהשתתף בייצוב ותחלופה של קומפלקסים בודדים 4,12,13,14. שינויים בסטטוס ההרכבה של SC תוארו בהקשר של מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים15,16 ועם תהליך ההזדקנות17.

לפיכך, שינויים בדפוסי SC תוארו בשמרים בהתאם למקור הפחמן המשמש לצמיחה2 ובתאי יונקים בתרבית כאשר גלוקוז מוחלף בגלקטוז4. שינויים דווחו גם בכבד עכברים לאחר צום8 ובאסטרוציטים כאשר חמצון חומצות השומן המיטוכונדריאלי נחסם18. בנוסף, ירידה או שינויים ב- SCs ו- OXPHOS נמצאו בתסמונת בארת19, אי ספיקת לב20, מספר הפרעות מטבוליות21 ונוירולוגיות 22,23,24, וגידולים שונים 25,26,27,28 . השאלה אם שינויים אלה בהרכבה וברמות SC הם הגורם העיקרי או מייצגים השפעות משניות במצבים פתולוגיים אלה עדיין נחקרת15,16. מתודולוגיות שונות יכולות לתת מידע על הרכבה ותפקוד של SCs; אלה כוללים מדידות פעילות 8,29, ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי30,31 ופרוטאומיקה32,33. חלופה שימושית שנמצאת בשימוש הולך וגובר ומהווה את נקודת המוצא לחלק מהמתודולוגיות שהוזכרו לעיל היא הקביעה הישירה של מצב הרכבה SC על ידי אלקטרופורזה מקורית כחולה (BN) שפותחה למטרה זו על ידי קבוצתו של Schägger34,35.

גישה זו דורשת פרוצדורות ניתנות לשחזור ויעילות כדי להשיג ולהמיס קרומי מיטוכונדריה וניתן להשלים אותה על ידי טכניקות אחרות כגון ניתוח פעילות בג’ל (IGA), אלקטרופורזה מממד שני וכתם מערבי (WB). מגבלה במחקרים על דינמיקת SC על ידי אלקטרופורזה BN יכולה להיות כמות התאים ההתחלתיים או דגימות רקמות. אנו מציגים סדרה של פרוטוקולים לניתוח הרכבה ותפקוד SC, המותאמים לשיטות הקבוצה של Schägger, שניתן ליישם על דגימות תאים או רקמות טריות או קפואות החל מ -20 מ”ג רקמה בלבד.

Protocol

הערה: ההרכב של כל אמצעי התרבות והמאגרים מצוין בטבלה 1 ופרטים הקשורים לכל החומרים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים. 1. בידוד מיטוכונדריה מתרבית תאים הערה: נפח התאים המינימלי שנבחן היה ~30-50 μL של תאים ארוזים (שלב 1.4)….

Representative Results

תפוקת המיטוכונדריה המתקבלת בעקבות הפרוטוקולים המתוארים לעיל משתנה בהתאם למספר גורמים כגון קו התא או סוג הרקמה, אופי הדגימות (כלומר, אם נעשה שימוש ברקמות טריות או קפואות), או יעילות תהליך ההומוגניזציה. יבולים צפויים של מיטוכונדריה מקווי תאים ורקמות שונים נאספים בטבלה 2. לאחר קבלת ?…

Discussion

ההתאמות המתודולוגיות שהוכנסו בפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו למנוע הפסדים ולהגדיל את התשואה תוך שמירה על פעילויות מורכבות במיטוכונדריה (שהיא חיונית כאשר הזמינות של כמויות מספיקות של דגימות נפגעת) ולשחזר את התבנית הצפויה של SCs ברקמה או בקו התא (ראו איור 2C). למטרה זו ומכיוון …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מספר “PGC2018-095795-B-I00” מ- Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) ועל ידי מענקים “Grupo de Referencia: E35_17R” ומענק מספר “LMP220_21” מ- Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) ל- PF-S ו- RM-L.

Materials

Acetic acid PanReac 131008
Aminocaproic acid Fluka Analytical 7260
ATP Sigma-Aldrich A2383
Bis Tris Acrons Organics 327721000
Bradford assay Biorad 5000002
Coomassie Blue G-250 Serva 17524
Coomassie Blue R-250 Merck 1125530025
Cytochrome c Sigma-Aldrich C2506
Diamino  benzidine (DAB) Sigma-Aldrich D5637
Digitonin Sigma-Aldrich D5628
EDTA PanReac 131669
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Fatty acids free BSA Roche 10775835001
Glycine PanReac A1067
Homogenizer Teflon pestle Deltalab 196102
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
K2HPO4 PanReac 121512
KH2PO4 PanReac 121509
Mannitol Sigma-Aldrich M4125
Methanol Labkem MTOL-P0P
MgSO4 PanReac 131404
Mini Trans-Blot Cell BioRad 1703930
MOPS Sigma-Aldrich M1254
MTCO1 Monoclonal Antibody Invitrogen 459600
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NADH Roche 10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels Invitrogen BN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x) Invitrogen BN2002
NativePAGE Running Buffer (20x)  Invitrogen BN2001
NDUFA9 Monoclonal Antibody Invitrogen 459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT) Sigma-Aldrich N6876
Pb(NO3)2 Sigma-Aldrich 228621
PDVF Membrane Amersham 10600023
Phenazine methasulfate (PMS) Sigma-Aldrich P9625
Pierce ECL Substrate Thermo Scientific 32106
PMSF Merck PMSF-RO
SDHA Monoclonal Antibody Invitrogen 459200
Sodium succinate Sigma-Aldrich S2378
Streptomycin/penicillin PAN biotech P06-07100
Sucrose Sigma-Aldrich S3089
Tris PanReac A2264
UQCRC1 Monoclonal Antibody Invitrogen 459140
XCell SureLock Mini-Cell Invitrogen  EI0001

References

  1. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  2. Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  3. Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).
  4. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  5. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  6. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  7. Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes. EMBO Rep. 24 (11), e57092 (2023).
  8. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  9. Milenkovic, D., et al. Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes. Cell Metab. 35 (10), 1799-1813 (2023).
  10. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  11. Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P., Ostojic, S. . Clinical Bioenergetics. , 3-60 (2021).
  12. Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain. Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).
  13. Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role. Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).
  14. Lopez-Fabuel, I., et al. Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).
  15. Mukherjee, S., Ghosh, A. Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases. Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).
  16. Nesci, S., et al. Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology. Life (Basel). 11 (3), 242 (2021).
  17. Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).
  18. Morant-Ferrando, B., et al. Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition. Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).
  19. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients. J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).
  20. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  21. Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935 (2020).
  22. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  23. Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600 (2020).
  24. Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging. Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).
  25. Hollinshead, K. E. R., et al. Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer. Cell Rep. 33 (1), 108231 (2020).
  26. Ikeda, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance. Nat Commun. 10 (1), 4108 (2019).
  27. Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer. Front Cell Dev Biol. 10, 717881 (2022).
  28. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers (Basel). 11 (7), 1027 (2019).
  29. Moreno-Loshuertos, R., et al. How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria. Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).
  30. Vonck, J., Schafer, E. Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).
  31. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  32. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  33. Gonzalez-Franquesa, A., et al. Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity. Cell Rep. 35 (8), 109180 (2021).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).
  35. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  36. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. J Vis Exp. (49), e2452 (2011).
  37. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182 (2019).
  38. Schagger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).
  39. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  40. Chomyn, A., et al. Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals–and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers. Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).
  41. Moreno-Loshuertos, R., et al. Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants. Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).
  42. Fernández-Vizarra, E., Fernández-Silva, P., Enríquez, J. A., Celis, J. E. . Cell Biology (Third Edition). , 69-77 (2006).
  43. Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332 (2021).

Play Video

Cite This Article
Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples . J. Vis. Exp. (207), e66771, doi:10.3791/66771 (2024).

View Video