פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.
במהלך העשורים האחרונים, הראיות שהצטברו על קיומם של סופרקומפלקסים נשימתיים (SCs) שינו את הבנתנו את ארגון שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה, והולידו את הצעת “מודל הפלסטיות”. מודל זה מניח את הדו-קיום של פרופורציות שונות של SCs וקומפלקסים בהתאם לרקמה או למצב חילוף החומרים הסלולרי. האופי הדינמי של ההרכבה ב-SCs יאפשר לתאים לייעל את השימוש בדלקים זמינים ואת יעילות העברת האלקטרונים, למזער את ייצור מיני החמצן הריאקטיביים ולהעדיף את יכולתם של התאים להסתגל לשינויים סביבתיים.
לאחרונה דווח על חריגות בהרכבת SC במחלות שונות כגון הפרעות נוירודגנרטיביות (אלצהיימר ופרקינסון), תסמונת בארת’, תסמונת לי או סרטן. התפקיד של שינויים הרכבה SC בהתקדמות המחלה עדיין צריך להיות מאושר. עם זאת, הזמינות של כמויות מספיקות של דגימות כדי לקבוע את מצב הרכבה SC הוא לעתים קרובות אתגר. זה קורה עם ביופסיה או דגימות רקמה קטנות או שיש לחלק אותן לניתוחים מרובים, עם תרביות תאים שיש להם צמיחה איטית או מגיעים מהתקנים מיקרופלואידים, עם כמה תרביות ראשוניות או תאים נדירים, או כאשר יש לנתח את ההשפעה של טיפולים יקרים מסוימים (עם ננו-חלקיקים, תרכובות יקרות מאוד וכו ‘). במקרים אלה נדרשת שיטה יעילה וקלה ליישום. מאמר זה מציג שיטה המותאמת להשגת שברים מיטוכונדריאליים מועשרים מכמויות קטנות של תאים או רקמות כדי לנתח את המבנה והתפקוד של SCs מיטוכונדריאליים על ידי אלקטרופורזה טבעית ואחריה בדיקות פעילות בג’ל או כתם מערבי.
סופרקומפלקסים (SCs) הם קשרים על-מולקולריים בין קומפלקסים בודדים של שרשרת הנשימה 1,2. מאז הזיהוי הראשוני של SCs ותיאור הרכבם על ידי קבוצת Schägger 2,3, שאושר מאוחר יותר על ידי קבוצות אחרות, נקבע כי הם מכילים מתחמי נשימה I, III ו- IV (CI, CIII ו- CIV, בהתאמה) בסטואיכיומטריות שונות. ניתן להגדיר שתי אוכלוסיות עיקריות של SCs, אלה המכילות CI (ו- CIII בלבד או CIII ו- CIV) ובעלות משקל מולקולרי גבוה מאוד (MW, החל ~ 1.5 MDa עבור SC הקטן יותר: CI + CIII2) ואלה המכילות CIII ו- CIV אך לא CIV, עם גודל קטן בהרבה (כגון CIII2 + CIV עם ~ 680 kDa). SCs אלה מתקיימים יחד בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי עם קומפלקסים חופשיים, גם בפרופורציות שונות. לכן, בעוד CI נמצא בעיקר בצורותיו הקשורות (כלומר, ב- SCs: ~ 80% בלב בקר ויותר מ -90% בסוגי תאים אנושיים רבים)3, CIV שופע מאוד בצורתו החופשית (יותר מ -80% בלב בקר), כאשר CIII מראה התפלגות מאוזנת יותר (~ 40% בצורתו החופשית השופעת יותר, כעמום, בלב בקר).
בעוד קיומם מקובל כיום, תפקידם המדויק עדיין נתון לוויכוח 4,5,6,7,8,9,10. על פי מודל הפלסטיות, פרופורציות שונות של SCs וקומפלקסים בודדים יכולים להתקיים בהתאם לסוג התא או למצב המטבולי 1,7,11. אופי דינמי זה של ההרכבה יאפשר לתאים לווסת את השימוש בדלקים זמינים ואת היעילות של מערכת הזרחן החמצוני (OXPHOS) בתגובה לשינויים סביבתיים 4,5,7. SCs יכולים גם לתרום לשליטה בקצב ייצור מיני חמצן תגובתי ולהשתתף בייצוב ותחלופה של קומפלקסים בודדים 4,12,13,14. שינויים בסטטוס ההרכבה של SC תוארו בהקשר של מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים15,16 ועם תהליך ההזדקנות17.
לפיכך, שינויים בדפוסי SC תוארו בשמרים בהתאם למקור הפחמן המשמש לצמיחה2 ובתאי יונקים בתרבית כאשר גלוקוז מוחלף בגלקטוז4. שינויים דווחו גם בכבד עכברים לאחר צום8 ובאסטרוציטים כאשר חמצון חומצות השומן המיטוכונדריאלי נחסם18. בנוסף, ירידה או שינויים ב- SCs ו- OXPHOS נמצאו בתסמונת בארת19, אי ספיקת לב20, מספר הפרעות מטבוליות21 ונוירולוגיות 22,23,24, וגידולים שונים 25,26,27,28 . השאלה אם שינויים אלה בהרכבה וברמות SC הם הגורם העיקרי או מייצגים השפעות משניות במצבים פתולוגיים אלה עדיין נחקרת15,16. מתודולוגיות שונות יכולות לתת מידע על הרכבה ותפקוד של SCs; אלה כוללים מדידות פעילות 8,29, ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי30,31 ופרוטאומיקה32,33. חלופה שימושית שנמצאת בשימוש הולך וגובר ומהווה את נקודת המוצא לחלק מהמתודולוגיות שהוזכרו לעיל היא הקביעה הישירה של מצב הרכבה SC על ידי אלקטרופורזה מקורית כחולה (BN) שפותחה למטרה זו על ידי קבוצתו של Schägger34,35.
גישה זו דורשת פרוצדורות ניתנות לשחזור ויעילות כדי להשיג ולהמיס קרומי מיטוכונדריה וניתן להשלים אותה על ידי טכניקות אחרות כגון ניתוח פעילות בג’ל (IGA), אלקטרופורזה מממד שני וכתם מערבי (WB). מגבלה במחקרים על דינמיקת SC על ידי אלקטרופורזה BN יכולה להיות כמות התאים ההתחלתיים או דגימות רקמות. אנו מציגים סדרה של פרוטוקולים לניתוח הרכבה ותפקוד SC, המותאמים לשיטות הקבוצה של Schägger, שניתן ליישם על דגימות תאים או רקמות טריות או קפואות החל מ -20 מ”ג רקמה בלבד.
ההתאמות המתודולוגיות שהוכנסו בפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו למנוע הפסדים ולהגדיל את התשואה תוך שמירה על פעילויות מורכבות במיטוכונדריה (שהיא חיונית כאשר הזמינות של כמויות מספיקות של דגימות נפגעת) ולשחזר את התבנית הצפויה של SCs ברקמה או בקו התא (ראו איור 2C). למטרה זו ומכיוון …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מספר “PGC2018-095795-B-I00” מ- Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) ועל ידי מענקים “Grupo de Referencia: E35_17R” ומענק מספר “LMP220_21” מ- Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) ל- PF-S ו- RM-L.
Acetic acid | PanReac | 131008 | |
Aminocaproic acid | Fluka Analytical | 7260 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Bis Tris | Acrons Organics | 327721000 | |
Bradford assay | Biorad | 5000002 | |
Coomassie Blue G-250 | Serva | 17524 | |
Coomassie Blue R-250 | Merck | 1125530025 | |
Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | |
Diamino benzidine (DAB) | Sigma-Aldrich | D5637 | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 | |
EDTA | PanReac | 131669 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Fatty acids free BSA | Roche | 10775835001 | |
Glycine | PanReac | A1067 | |
Homogenizer Teflon pestle | Deltalab | 196102 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
K2HPO4 | PanReac | 121512 | |
KH2PO4 | PanReac | 121509 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
Methanol | Labkem | MTOL-P0P | |
MgSO4 | PanReac | 131404 | |
Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
MTCO1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459600 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NADH | Roche | 10107735001 | |
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels | Invitrogen | BN1001BOX | |
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x) | Invitrogen | BN2002 | |
NativePAGE Running Buffer (20x) | Invitrogen | BN2001 | |
NDUFA9 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459100 | |
Nitroblue tetrazolium salt (NBT) | Sigma-Aldrich | N6876 | |
Pb(NO3)2 | Sigma-Aldrich | 228621 | |
PDVF Membrane | Amersham | 10600023 | |
Phenazine methasulfate (PMS) | Sigma-Aldrich | P9625 | |
Pierce ECL Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
PMSF | Merck | PMSF-RO | |
SDHA Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459200 | |
Sodium succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
Streptomycin/penicillin | PAN biotech | P06-07100 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S3089 | |
Tris | PanReac | A2264 | |
UQCRC1 Monoclonal Antibody | Invitrogen | 459140 | |
XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |