Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters

Supercomplexen (SC’s) zijn supramoleculaire associaties tussen individuele respiratoire ketencomplexen ^1,2. Sinds de eerste identificatie van SC’s en de beschrijving van hun samenstelling door de groep van Schägger ^2,3, later bevestigd door andere groepen, werd vastgesteld dat ze respiratoire complexen I, III en IV (respectievelijk Ci, CIII en CIV) bevatten in verschillende stoichiometrieën. Er kunnen twee hoofdpopulaties van SC’s worden gedefinieerd, die met CI (en ofwel CIII alleen of CIII en CIV) en met een zeer hoog moleculair gewicht (MW, beginnend met ~1,5 MDa voor de kleinere SC: CI + CIII₂) en die met CIII en CIV maar niet met CI, met een veel kleinere omvang (zoals CIII₂ + CIV met ~680 kDa). Deze SC’s bestaan naast elkaar in het binnenste mitochondriale membraan met vrije complexen, ook in verschillende verhoudingen. Dus, terwijl CI meestal wordt aangetroffen in de geassocieerde vormen (dat wil zeggen, in SC’s: ~80% in runderhart en meer dan 90% in veel menselijke celtypen)³, is CIV zeer overvloedig in zijn vrije vorm (meer dan 80% in runderhart), waarbij CIII een meer evenwichtige verdeling vertoont (~40% in zijn meer overvloedige vrije vorm, als een dimeer, in runderhart).

Hoewel hun bestaan nu algemeen wordt aanvaard, staat hun precieze rol nog ter discussie 4,5,6,7,8,9,10. Volgens het plasticiteitsmodel kunnen er verschillende verhoudingen van SC’s en individuele complexen bestaan, afhankelijk van het celtype of de metabole status ^1,7,11. Deze dynamische aard van de assemblage zou cellen in staat stellen het gebruik van beschikbare brandstoffen en de efficiëntie van het oxidatieve fosforyleringssysteem (OXPHOS) te reguleren als reactie op veranderingen in het milieu ^4,5,7. SC’s kunnen ook bijdragen aan het beheersen van de generatiesnelheid van reactieve zuurstofsoorten en deelnemen aan de stabilisatie en omzet van individuele complexen 4,12,13,14. Veranderingen van de SC-assemblagestatus zijn beschreven in verband met verschillende fysiologische en pathologische situaties^15,16 en met het verouderingsproces¹⁷.

Zo zijn er veranderingen in de SC-patronen beschreven in gist, afhankelijk van de koolstofbron die wordt gebruikt voor groei² en in gekweekte zoogdiercellen wanneer glucose wordt vervangen door galactose⁴. Modificaties zijn ook gemeld in de lever van muizen na vasten⁸ en in astrocyten wanneer de oxidatie van mitochondriale vetzuren wordt geblokkeerd¹⁸. Daarnaast zijn er een afname of veranderingen in SC’s en OXPHOS gevonden bij Barth-syndroom¹⁹, hartfalen²⁰, verschillende metabole²¹ en neurologische 22,23,24 aandoeningen en verschillende tumoren 25,26,27,28. Of deze veranderingen in de samenstelling en niveaus van SC een primaire oorzaak zijn of secundaire effecten vertegenwoordigen in deze pathologische situaties, wordt nog onderzocht^15,16. Verschillende methodologieën kunnen informatie geven over de samenstelling en functie van SC’s; Deze omvatten activiteitsmetingen ^8,29, ultrastructurele analyse^30,31 en proteomics ^32,33. Een bruikbaar alternatief dat steeds vaker wordt gebruikt en het uitgangspunt vormt voor enkele van de eerder genoemde methodologieën, is de directe bepaling van de SC-assemblagestatus door middel van Blue native (BN) elektroforese die voor dit doel is ontwikkeld door Schäggers groep^34,35.

Deze aanpak vereist reproduceerbare en efficiënte procedures om mitochondriale membranen te verkrijgen en op te lossen en kan worden aangevuld met andere technieken zoals in-gel activiteitsanalyse (IGA), tweede-dimensie elektroforese en western blot (WB). Een beperking in de studies naar SC-dynamica door BN-elektroforese kan de hoeveelheid startcellen of weefselmonsters zijn. We presenteren een reeks protocollen voor de analyse van de assemblage en functie van SC, aangepast aan de groepsmethoden van Schägger, die kunnen worden toegepast op verse of bevroren cel- of weefselmonsters vanaf slechts 20 mg weefsel.