Erken Yaşamın Kritik Bir Döneminde Juvenil Beyin Koku Alma Duyusal Nöron Sinaptik Bağlantısının Deneyime Bağlı Yeniden Modellenmesi
Summary
Burada, Drosophila juvenil beynindeki anten lobu sinaptik glomerüllerinin koku alma deneyimine bağlı yeniden şekillenmesini indükleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz.
Abstract
Erken yaşam koku alma duyusal deneyimi, Drosophila çocuk beyninde, deneyimsel olarak doza bağımlı, zamansal olarak kısıtlı ve yalnızca kısa, iyi tanımlanmış bir kritik dönemde geçici olarak geri dönüşümlü olan dramatik sinaptik glomerül yeniden şekillenmesine neden olur. Beyin devresi sinaptik bağlantı yeniden şekillenmesinin yönlülüğü, koku alma duyu nöronlarının yanıt veren reseptör sınıfına etki eden spesifik koku verici tarafından belirlenir. Genel olarak, her nöron sınıfı sadece tek bir koku reseptörünü eksprese eder ve tek bir koku alma sinaptik glomerulusunu innerve eder. Drosophila genetik modelinde, koku alma glomerüllerinin tam dizisi, koku verici duyarlılığı ve davranışsal çıktı ile tam olarak haritalanmıştır. Etil bütirat (EB) koku verici, VM7 glomerulusunu innerve eden Or42a reseptör nöronlarını aktive eder. Erken yaşam kritik döneminde, EB deneyimi, Or42a koku alma duyu nöronlarında doza bağlı sinaps eliminasyonunu yönlendirir. Dozlanmış EB koku maruziyetinin zamanlanmış periyotları, çocuk beyninde deneyime bağlı devre bağlantı budamasının araştırılmasına izin verir. Anten lob sinaptik glomerüllerinin konfokal mikroskopi görüntülemesi, sinaps sayısı ve innervasyon hacminin ölçülmesini sağlayan Or42a reseptörü güdümlü transgenik belirteçlerle yapılır. Gelişmiş Drosophila genetik araç seti, beyin devresinin yeniden şekillenmesine aracılık eden hücresel ve moleküler mekanizmaların sistematik olarak incelenmesini sağlar.
Introduction
Erken yaşamda genç beyin devrelerinin yeniden şekillenmesi, bir hayvanın doğduğu oldukça değişken, öngörülemeyen ortama uyacak şekilde büyük ölçekli sinaptik bağlantı değişiklikleri için son şansı temsil eder. En bol bulunan hayvan grubu olan böcekler, bu evrimsel olarak korunmuş, temel kritik dönem yeniden şekillenme mekanizmasını paylaşırlar1. Kritik dönemler, duyusal girdinin başlamasıyla açılır, bağlantıyı optimize etmek için tersine çevrilebilir devre değişiklikleri sergiler ve ardından stabilizasyon kuvvetleri daha fazla yeniden şekillenmeye direndiğinde kapanır2. Böcekler özellikle koku alma duyusal bilgisine bağımlıdır ve iyi tanımlanmış bir koku alma kritik periyodu gösterir. Drosophila, çocuk beynindeki bu deneyime bağlı kritik dönemi araştırmak için mükemmel bir genetik model sunar. Eklosyonu takip eden ilk birkaç gün boyunca koku deneyimi, bireysel olarak tanımlanan sinaptik glomerüllerde çarpıcı devre bağlantı değişikliklerine neden olur 3,4. Yeniden şekillenme yönü, spesifik giriş koku verici deneyimine bağlıdır. Bazı koku vericiler, eklosiyon sonrası (dpe)3,5,6,7 sonrası birkaç gün boyunca sinaptik glomerulus hacminde bir artışa neden olurken, diğer koku vericiler 0-2 dpe kritik dönemde sinapsların hızlı bir şekilde elimine edilmesine neden olarak innervasyon hacminin azalmasına neden olur 8,9,10. Spesifik olarak, etil bütirat (EB) koku verici deneyimi, Or42a koku alma reseptörü nöronlarının doza bağlı sinaptik budamasını yalnızca bu erken yaşam kritik döneminde8 yönlendirir. Sinaps eliminasyonu, kritik periyot içinde EB koku girdisini modüle ederek tamamen geri dönüşümlüdür, ancak kritik periyodun kapanmasını takiben kalıcı hale gelir. Bu koku alma deneyimine bağlı sinaptik budama, genç beyin devresinin yeniden şekillenmesinin altında yatan zamansal olarak kısıtlı mekanizmaları aydınlatmak için değerli bir deneysel sistem sağlar.
Burada, erken yaşam kritik döneminde Or42a reseptörü koku alma duyu nöronlarının EB deneyimine bağlı sinaptik budamasını indüklemek ve analiz etmek için kullanılan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Anten lob VM7 glomerulusundaki Or42a sinaptik terminallerinin, doğrudan Or42a promotörüne (Or42a-mCD8::GFP)11 kaynaşmış veya Gal4/UAS ikili ifade sistemi (Or42a-Gal4 kullanan UAS-mCD8::GFP)12 kullanılarak, membrana bağlı bir mCD8::GFP işaretleyicisinin transgenik olarak sürülmesiyle spesifik olarak etiketlenebileceğini gösteriyoruz. Bireysel Or42a nöron sinapsları, bir dizi floresan etikete (örneğin, Bruchpilot::RFP)8 kaynaşmış presinaptik aktif bölge belirteçlerinin hedeflenmiş transgenik ekspresyonu veya ultrastrüktürel sinaps analizleri için elektron yoğun bir sinyal (örneğin, miniSOG-mCherry)8 kullanılarak benzer şekilde etiketlenebilir. OR42a sinaptik terminalleri, lazer taramalı konfokal mikroskopi ve transmisyon elektron mikroskobunun bir kombinasyonu ile görüntülenebilir. Or42a sinaptik glomerül budamasının EB dozuna bağımlı olduğunu ve zamanlanmış koku verici deneyiminin konsantrasyonuna ölçeklendiğini gösteriyoruz. Bir araç olarak kullanılan mineral yağda çözünen EB koku maddesinin yüzdesi, gelişimsel olarak evrelenmiş hayvanlarda koku maddesine maruz kalmanın zamanlanmış süresi gibi değişebilir. Son olarak, VM7 innervasyon floresan yoğunluğunu ve hacmini ölçerek sinaptik glomerül budamasının kapsamını analiz etmek için kullanılan yöntemleri gösteriyoruz. Sinaps sayısı ayrıca etiketli sinaptik punkta sayılarak ve transmisyon elektron mikroskobu8 kullanılarak sinaptik yapı parametreleri ölçülerek de ölçülebilir. Genel olarak, burada gösterilen protokol, genç kritik bir dönemde Drosophila koku alma devresi sinaptik bağlantı budamasına aracılık eden hem hücresel hem de moleküler mekanizmaların sistematik olarak diseksiyonunu sağlayan güçlü bir yaklaşımdır. Bu çalışmada açıklanan genel koku maruziyeti kurulumu, diğer kokular kullanılarak ve diğer glomerüller 3,7 kullanılarak önceki çalışmalarda kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan koku verici maruziyeti ve beyin görüntüleme protokolü, erken yaşamda kritik bir dönemde deneyime bağlı koku alma duyusal nöron sinaptik glomerül budamasını güvenilir bir şekilde indüklemek ve ölçmek için kullanılabilir. Koku alma devresinin yeniden şekillenmesini araştırmak için bu tedavi paradigmasını kullanan daha önceki çalışmalar, eklosiyondan 2. gün sonra koku maruziyetinebaşladı <sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diğer Broadie Lab üyelerine değerli katkıları için teşekkür ederiz. Figürler BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü hibeleri MH084989 ve K.B.’ye NS131557 desteklenmiştir.
Materials
| For Odor Exposure | |||
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-110 | |
| Ethyl butyrate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M3516 | |
| Odor chambers | Glasslock | ||
| Paint brushes | Winsor & Newton | Series 233 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Wire mesh | Scienceware | 378460000 | |
| Brain Dissection | |||
| Ethanol, 190 proof | Decon Labs | 2801 | Diluted to 70% |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumont #5 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscope Sciences | 157-8 | Diluted to 4% |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100B | |
| Phosphate-buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70011-044 | Diluted to 1x |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Sylgard | Electron Microscope Sciences | 24236-10 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Brain Immunocytochemistry | |||
| 488 goat anti-chicken | Invitrogen | A11039 | |
| 546 goat anti-rat | Invitrogen | A11081 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9647 | |
| Chicken anti-GFP | Abcam | 13970 | |
| Coverslips | Avantor | 48366-067 | 25 x 25 mm |
| Double-sided tape | Scotch | 34-8724-5228-8 | |
| Fluoromount-G | Electron Microscope Sciences | 17984-25 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 75 x 25 mm |
| Nail polish | Sally Hansen | 109 | Xtreme Wear, Invisible |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Rat anti-CadN | Developmental Studies Hybridoma Bank | AB_528121 | |
| Confocal/Analysis | |||
| Any computer/laptop | |||
| Confocal microscope | Carl Zeiss | Zeiss 510 META | |
| Fiji software | Fiji | Version 2.14.0/1.54f |
References
- English, S., Barreaux, A. M. The evolution of sensitive periods in development: insights from insects. Curr Opinion Behav Sci. 36, 71-78 (2020).
- Fabian, B., Sachse, S. Experience-dependent plasticity in the olfactory system of Drosophila melanogaster and other insects. Fron Cell Neurosci. 17, 1130091 (2023).
- Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
- Devaud, J. M., Acebes, A., Ramaswami, M., Ferrús, A. Structural and functional changes in the olfactory pathway of adult Drosophila take place at a critical age. J Neurobiol. 56 (1), 13-23 (2003).
- Sachse, S., et al. Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit. Neuron. 56 (5), 838-850 (2007).
- Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Pro Natl Acad Sci U S A. 108 (36), E646-E654 (2011).
- Kidd, S., Struhl, G., Lieber, T. Notch is required in adult Drosophila sensory neurons for morphological and functional plasticity of the olfactory circuit. PLoS Genet. 11 (5), e1005244 (2015).
- Golovin, R. M., Vest, J., Vita, D. J., Broadie, K. Activity-dependent remodeling of Drosophila olfactory sensory neuron brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 39 (16), 2995-3012 (2019).
- Golovin, R. M., Vest, J., Broadie, K. Neuron-specific FMRP roles in experience-dependent remodeling of olfactory brain innervation during an early-life critical period. J Neurosci. 41 (6), 1218-1241 (2021).
- Chodankar, A., Sadanandappa, M. K., Raghavan, K. V., Ramaswami, M. Glomerulus-selective regulation of a critical period for interneuron plasticity in the drosophila antennal lobe. J Neurosci. 40 (29), 5549-5560 (2020).
- Stephan, D., et al. Drosophila Psidin regulates olfactory neuron number and axon targeting through two distinct molecular mechanisms. J Neurosci. 32 (46), 16080 (2012).
- Doll, C. A., Broadie, K. Activity-dependent FMRP requirements in development of the neural circuitry of learning and memory. Development. 142 (7), 1346-1356 (2015).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. J Vis Exp. (118), e55128 (2016).
- Okumura, M., Kato, T., Miura, M., Chihara, T. Hierarchical axon targeting of Drosophila olfactory receptor neurons specified by the proneural transcription factors Atonal and Amos. Genes to Cells. 21 (1), 53-64 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Vita, D. J., Meier, C. J., Broadie, K. Neuronal fragile X mental retardation protein activates glial insulin receptor mediated PDF-Tri neuron developmental clearance. Nat Comm. 12 (1), 1160 (2021).
- Gugel, Z. V., Maurais, E. G., Hong, E. J. Chronic exposure to odors at naturally occurring concentrations triggers limited plasticity in early stages of Drosophila olfactory processing. eLife. 12, 85443 (2023).
